D-二聚体测定试剂(免疫比浊法)

附件3D-二聚体测定试剂（免疫比浊法）注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对D-二聚体测定试剂（免疫比浊法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对D-二聚体测定试剂（免疫比浊法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。

应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围从方法学考虑，在本文中D-二聚体测定试剂是指以胶乳凝集免疫比浊法为基本原理，利用全自动、半自动凝血分析仪；全—1 —自动、半自动生化分析仪或分光光度计，在医学实验室对人体血浆样本中D-二聚体含量进行体外定量分析的试剂。

依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号），D-二聚体测定试剂管理类别为二类，分类代号为6840。

本指导原则不适用于：（一）单独申请注册的D-二聚体校准品和质控品。

（二）免疫比浊法原理之外的其他D-二聚体测定试剂盒。

二、注册申报材料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性方面的说明、产品主要研究结果的总结和评价以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求，下面着重介绍与D-二聚体测定试剂预期用途有关的临床背景情况。

D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子ⅩⅢ交联后，经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，能够反映体内的凝血功能和纤溶活性，是机体高凝状态、血栓形成、继发性纤溶亢进的指标。

在深静脉血栓、肺栓塞、弥散性血管内凝血、重症肝炎等疾病中水平升高，以及溶栓治疗后均可见D-二聚体水平升高，可作为溶栓治疗的有效观察指标。

由于具有极高的敏感性和阴性预测—2 —值，临床上已经将D-二聚体阴性作为排除肺栓塞（pulmonary embolism，PE）、深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）形成的重要依据。

（二）主要原材料的研究资料（如需提供）主要原材料的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；质控品、校准品的原料选择、制备、定值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。

2.反应原理介绍。

3.检测方法的介绍：含样本采集、标准品和质控品、测试步骤、结果计算等。

4.反应体系研究：含样本采集及处理、样本要求（抗凝剂的选择）、样本用量、试剂用量、反应条件（波长、温度、时间等）、校准方法（如有）、质控方法等的研究资料。

5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

（四）分析性能评估资料企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、试验数据、统计方法等详细资料。

进行至少三个批次的验证。

对于D-二聚体测定试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。

—3 —1.精密度1.1重复性在重复性条件下，对不同浓度的样品分别重复测定10次，计算10次测定结果的平均值（X）和标准差（SD），根据公式（1）得出变异系数（CV），结果均应符合产品技术要求性能指标的要求。

CV=SD/X×100% (1)1.2批间差用质控血浆（正常血浆和异常血浆）分别测试3个不同批号的试剂，每个批号测试10次，分别计算两个水平测量值的平均值（X）和标准差（SD），按公式（1）计算变异系数（CV）。

2.准确度按以下优先顺序选择准确度性能评估方法：2.1相对偏差2.1.1用可用于评价常规方法的参考物质/有证参考物质（CRM）对试剂进行测试，重复检测3次，取测试结果均值（M），按公式（2）计算相对偏差（B）。

如果3次结果都符合要求，即判为合格。

如果大于等于2次的结果不合格，即判为不合格。

如果有1次结果不符合要求，则应重新连续测试20次，并分别按照公式（2）计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果符合要求，则准确度符合企业规定要求。

B=（M-T）/T (2)—4 —式中：M—测试结果均值；T—有证参考物质标示值，或各浓度人源样本定值。

注：首选国家参考物质，如无国家参考物质再选用国际参考物质。

2.1.2对企业参考品进行检测用定值的企业参考品对试剂进行测试，重复检测3次，取测试结果均值（M），按公式（2）计算相对偏差（B）。

如果3次结果都符合要求，即判为合格。

如果大于等于2次的结果不合格，即判为不合格。

如果有1次结果不符合要求，则应重新连续测试20次，并分别按照公式（2）计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果符合要求，则准确度符合企业规定要求。

2.2比对实验参考《体外诊断试剂分析性能评估（准确度—方法学比对）技术审查指导原则》及CLSI的EP9—A2《用患者样本进行方法比对及偏倚估：批准指南——第二版》进行准确度评估。

方法：用不少于40个覆盖检测浓度范围内不同浓度的人源样品，以生产企业指定的试剂作为比对方法，每份样品按待测试剂及比对试剂的操作方法分别检测。

线性回归计算两组结果的相关系数（r）、斜率及偏差，结果应符合企业规定要求。

2.3回收实验参考《体外诊断试剂分析性能评估（准确度—回收实验）技术审查指导原则》（食药监办械函〔2011〕116号）要求完成准—5 —确度评估。

方法：选择接近参考区间的常规检测样本，分为体积相同的3—4份，在其中2—3份样本中加入不同浓度相同体积的待测物标准液制备待回收分析样本，加入体积小于原体积的10%，制成2—3个不同浓度的待回收分析样本，计算加入的待测物的浓度。

在另一份样本中加入同样体积的无待测物的溶剂，制成基础样本。

用待评价系统对待回收分析样本和基础样本进行测定，通常对样本进行3次重复测定，计算均值，取其均值进行下述计算。

数据处理及结果报告：用公式（3）计算回收率：（3）式中：R—回收率；V—加入待测物标准液的体积；V0—基础样本的体积C—基础样本加入待测标准物质后的检测浓度；C0—基础样本的检测浓度；Cs—待测物标准液的浓度。

3.线性建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似。

在浓度梯度的选择上，应使用具有溯源性的具有浓度差的样本，或经上一级方法或临床已注册上市的试剂盒验证—6 —其测值真实性的样本，样本浓度应适当覆盖其线性范围。

线性范围不得窄于企业预期的测定范围。

用接近D-二聚体测试区间上限的高浓度样品和缓冲液稀释成至少5个稀释浓度（xi）；每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值（yi）。

以稀释浓度（xi）为自变量，以测定结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程。

按公式计算线性回归的相关系数（r）。

不强制要求企业对线性范围内的偏差进行分段评估，如不分段，各浓度的相对偏差应≤±10%。

如分段，则分界点设置不宜过高，高于分界点的浓度相对偏差应≤±10%，低于分界点的浓度绝对偏差应不高于分界点浓度的±10%。

目前，国内外厂家的线性区间一般为0.5—30μg/mL（DDU 单位）或0.2—4μg/mL（FEU单位）。

4.特异性4.1溶血（血红蛋白）、脂血（甘油三酯）、黄疸（胆红素）、类风湿因子等干扰因素对检测结果的影响。

4.2样本中其他可能干扰试剂反应的物质对检测结果的影响。

4.3资料中所提到的干扰物质，其干扰程度均不应使用模糊的描述方式，而应细化到干扰量，并提供相应的试验数据予以支持。

5.校准品及质控品参照GB/T 21415—2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，提供企—7 —业（工作）校准品及试剂盒配套校准品定值及不确定度计算相关资料，提供质控品赋值及其质控范围确定的相关资料。

同时，应对校准品、质控品的赋值结果的瓶内均匀性、瓶间均匀性，以及其赋值结果的准确度进行评价。

如校准品或质控品的基体不同于临床常用样本类型，还应提交校准物质互换性的相关研究资料。

6.其他需注意问题6.1对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有适用机型的性能评估资料。

6.2如注册申请中包含不同的包装规格，需要对不同包装规格之间的差异进行分析或验证。

如不同的包装规格产品间存在性能差异，需要提交采用每个包装规格产品进行的上述项目评估的试验资料及总结。

如不同包装规格之间不存在性能差异，需要提交包装规格之间不存在性能差异的详细说明，具体说明不同包装规格之间的差别及可能产生的影响。

6.3试剂空白吸光度、分析灵敏度，执行GB/T 26124—2011临床化学体外诊断试剂中有关要求。

（五）参考区间确定资料应提交验证参考区间所采用样本来源及详细的试验资料。

应明确参考人群的筛选标准，研究各组（如性别、年龄等）例数不应低于120例。

参考值研究结果应在说明书【参考区间】项中进行相应说明。

特别强调：D-二聚体参考区间的确定对于静脉血栓形成的排除诊断至关重要。

传统的以正常人群测定结果分布的95%置信区—8 —间作为参考区间的方法对于本产品帮助不大。

应以可获得深静脉血栓形成诊断最佳敏感性或阴性预测值作为临界值的判断指标。

各实验室应该以对疑诊深静脉血栓形成的患者经过客观影像学检验证实的临床研究中确立针对该特定检测方法和特定人群的检测界限。

（六）稳定性研究资料稳定性研究主要包括注册单元中所有组成部分的效期稳定性及开瓶（复溶）稳定性等，如有需要可增加运输稳定性、机载稳定性、样本稳定性研究等。

如试剂需要配制，还应对配制后试剂的稳定性进行研究。

企业可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。

常用的稳定性研究方案为证实试剂在经过被作用于指定条件后，仍能满足主要性能指标要求与未被作用于指定条件的试剂性能一致。

稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体方法及过程。

对于实时稳定性研究，应提供至少3批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

（七）临床评价资料按照《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）及《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）执行。