酿酒酵母INO1基因的克隆

酿酒酵母INO1基因的克隆

黄贞杰1,2,3，叶冰莹1,2,3，陈由强1,2,3★

（1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350108；2.农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350108；3.发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室，福建福州350108）

摘要利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，扩增得到酿酒酵母的结构基因，大小为1537bp的序列。利用NCBI对此序列进行比对，发现此序列与酿酒酵母S288C的催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1的第41到1577位序列有100％的同源性，而INO1的完整CDS是1602bp。由此可见克隆得到的结构基因是酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，但不是全长。

关键词INO1;酿酒酵母；基因克隆

Cloning of INO1 Gene from Saccharomyces cerevisiae S288C Abstract The Saccharomyces cerevisiae inositol-3-phosphate synthase encodes gene( INO1) is amplified from a genomic DNA of S.ce s288c by PCR. sequence amplified size is 1537bp.It have 100% homology with INO1 gene complete sequence from 41 to 1577 had reported. but not complete cds.

Keywords INO1 ;Saccharomyces cerevisiae ;cloning of gene

0 引言

随着石油能源日益耗竭，国内外许多科学家开始研究利用生物质生产燃料乙醇。乙醇被公认为不仅是一种可以代替汽油的优良液体燃料，而且是很好的燃油品质改善剂。利用非粮生物质原料生产燃料乙醇对于我国现状来说将成为一项迫切、具有重要现实意义的任务。利用甘蔗生成燃料乙醇可以充分弥补利用粮食作为原材料的不足，巴西利用甘蔗生产燃料酒精的成功充分说明了这一点。然而,发酵终点高浓度的乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈抑制作用,而提高酵母菌的乙醇耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高的发酵性能,因此酵母菌的乙醇耐性重新成为世界范围内的研究热点。采用分子遗传与代谢控制育种的方法筛选高产燃料乙醇的酿酒酵母具有重要的意义。

肌醇对真核生物细胞的生长是必需的。它不仅是磷脂酰肌醇(PI)合成的前体，而且对磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰胆碱(Pc)和心磷脂(CL)合成有关酶类的表达具有调控作用[1]。池振明等研究[2]发现，在培养基中添加肌醇在某种程度上可以对耐酒精酵母菌W4的蔗糖酶分泌和细胞的生长起解葡萄糖阻遏的作用。在乙醇胁迫下，Ino1的表达被证明不可缺少[3],低的肌醇量影响细胞内物质的泄漏，从而影响细胞内PH、H+—ATPase的活性，改变细胞质离子稳态，进而影响膜透性屏障。高的肌醇量使ATPase的活性提高，抵偿质子流入量，触发改变脂质组成，最终提高乙醇耐受性。Min-Eui Hong等[4]通过反向代谢工程发现过表达酿酒酵母四个内源基因（INO1, DOG1, HAL1,MSN2）可以促进乙醇的耐性。而过表达INO1的酵母菌具有最高的乙醇耐性，在高浓度葡萄糖下发酵具有较高的效价和体积产率。

综上，为了进一步提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇的效率，本研究试图通过构建整合表达载体过表达催化葡萄糖6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，得到能够耐高乙醇，较强细胞活力，发酵甘蔗汁产较高乙醇量的工程菌株。本实验首先利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，克隆INO1基因，为下一步在工业酿酒酵母中过表达，构建工程菌株奠定基础。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌株和质粒

酿酒酵母S288C：大连理工大学生命科学与技术学院惠赠；大肠杆菌DH5α由福建师范大学农业部甘蔗遗传改良重点实验室保存。pMD-19T克隆载体购于TAKARA公司。

1.1.2培养基和培养条件

YPD培养基（g/L）：酵母提取物10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g，pH自然，1×105 Pa 灭菌20 min。培养温度为30 ℃ 200 rpm。大肠杆菌利用LB培养基，37 ℃，对于转化的细菌培养基中加入100 µg／mL的氨苄青霉素。

1.1.3 试验试剂

Ex Taq酶、酵母基因组DNA提取试剂盒购于TAKARA公司，PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。质粒小提取试剂盒（天根生化科技有限公司）； SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)；其他分子生物学试剂均购于TAKARA公司与Sigma公司。其他生化试剂的配制参照分子克隆实验指南。

1.1.4 主要仪器和设备

全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技）；2720 Thermal Cycler PCR仪(Applied Biosystems)；DYY26B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；GeneQuant pro分光光度计(Amersham Biosciences)；TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1酿酒酵母基因组提取

原始酿酒酵母菌株s288c活化后，使用YPD固体培养基进行平皿划线分离得到酿酒酵母菌株s288c单菌落，牙签挑取单菌落接至50 ml YPD液体培养基进行30 ℃摇瓶培养24-30 h，离心去上清；按照Takara公司酿酒酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 INO1基因序列扩增

根据NCBI上已知的酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶编码基因INO1用引物设计软件设计引物，引物序列如下：

上游引物5’- TAGTTACCGACAAGTGCACGTACA -3'，

下游引物5'-AGTTCGTTTTGAGAAGGCAATCCA -3'

以酿酒酵母S288C基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应条件如下：预变性94℃ 5 min，变性94℃30s，退火54℃ 30s,延伸72℃ 97s，30个循环，延长72℃10min保存4℃。反应结束后取2 uL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用Promega公司的胶回收试剂盒SV Gel and PCR Clean-Up System进行胶回收。

1.2.3 INO1基因克隆

1.2.3.1 PCR回收产物的连接与转化

取回收后的PCR产物与PMD-19T载体进行连接(表1)。连接产物采用CaCl2法转化E. coli DH5α感受态细胞。在含有IPTG与X–gal 的LB/Amp平板上进行蓝白斑筛选。