毕赤酵母重组子的MDMM签定方法

培养基的配方：

YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）；

MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂

MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖

操作方法：

用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。

用点MM、MD平板点方法。

准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。

原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。

MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。

用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

酵母菌可以利用有机物和无机物作为氮源，有机氮源有酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨等，无机氮源有尿素、醋酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵等铵盐。