畜禽肉及肉制品中牛羊猪鸡鸭源性成分定性PCR检测方法湖北标准2020版

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畜禽肉及肉制品中牛羊猪鸡鸭源性成分

定性PCR 检测方法

1范围

本文件规定了牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）、猪（家猪和野猪）、鸡、鸭源性成分的定性PCR检测方法。

本文件适用于牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）、猪（家猪和野猪）、鸡、鸭的肉及肉制品中源性成分的定性PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T 27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

根据牛、羊、猪、鸡和鸭的物种特异性序列，设计特异性引物，对待检样品提取的DNA进行PCR扩增，依据扩增特异性片段的结果，判断待检样品中是否含有牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分。

5试剂和材料

5.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。

5.2琼脂糖。

5.3

GelRed 核酸染料。

注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料作为核酸电泳的染色剂。5.410mol/L 氢氧化钠溶液：在160mL 水中加入80.0g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温，再加水定容至200mL。

5.50.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取18.6g 乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na 2），加

入70mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（5.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.4）调pH 至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

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5.61mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL 水中，用盐酸（HCl）调pH 至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

5.75mol/L 氯化钠溶液：称取29.22g 氯化钠（NaCl）溶于80mL 水中，加水定容至100mL。在103.4kPa 蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min。

5.810%十二烷基磺酸钠溶液：称取10g 十二烷基磺酸钠（C 12H 25SO 4Na，SDS），加入80mL 水中，加

热至完全溶解后，冷却至室温，加水定容至100mL。在103.4kPa 蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min。

5.9DNA 提取细胞裂解液：量取200mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5），200mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.6），40mL 氯化钠溶液（5.7），200mL 十二烷基磺酸钠溶液（5.8），混合后用水定容至1000mL，室温保存，备用。

5.1020mg/mL 蛋白酶K 溶液：将200mg 蛋白酶K（Proteinase K）溶于9.5mL 水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至10mL。于-20℃保存备用。

5.11Tris-饱和酚。

5.12氯仿：异戊醇(24:1)：将氯仿和异戊醇按照24:1的比例配制。

5.13无水乙醇。

5.1475%乙醇。

5.15TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取10mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.6）和2mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5）溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

5.1650×TAE 缓冲液：称取242.2g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用500mL 水加热搅拌溶解后，加入100mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5），用冰乙酸调pH 至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。

5.17Taq 酶。

5.1810×PCR 缓冲液。

5.19dNTP 混合液。

5.206×DNA 上样缓冲液。

5.21DNA 分子量标记：可清楚的区分100bp～1000bp 的DNA 片段。

5.22物种特异性引物（表1）。

5.23引物溶液：用TE 缓冲液（5.15）或水分别将引物稀释到10µmol/L。

5.24PCR 产物回收试剂盒。

表1

物种特异性引物信息物种

引物名称引物序列片段大小/bp 牛Bovinae-F

5′-CAGACAAAGGTCAGGAAGTAATC-3′223Bovinae-R

5′-AGATGAGGGAAGAGCAGGTCTG-3′羊Ovis-F

5′-GCAAGAATGGCACCCAAGAC-3′237Ovis-R

5′-TGCCATGTGTGCCGCATTTG-3′猪Sus-F

5′-GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3′154Sus-R

5′-TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3′鸡Gallus-F

5′-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3′252Gallus-R

5′-AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3′鸭Anas-F

5′-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3′222

Anas-R 5′-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3′