晶型药物常用的检测 分析 方法

晶型药物常用的检测 分析 方法

物质在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间键合方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构。同一物质具有两种或两种以上的空间排列和晶胞参数，形成多种晶型的现象称为多晶现象(polymorphism)。虽然在一定的温度和压力下，只有一种晶型在热力学上是稳定的，但由于从亚稳态转变为稳态的过程通常非常缓慢，因此许多结晶药物都存在多晶现象。固体多晶型包括构象型多晶型、构型型多晶型、色多晶型和假多晶型。
药物分子通常有不同的固体形态，包括盐类，多晶，共晶，无定形，水合物和溶剂合物;同一药物分子的不同晶型，在晶体结构，稳定性，可生产性和生物利用度等性质方面可能会有显著差异，从而直接影响药物的疗效以及可开发性。如果没有很好的评估并选择最佳的药物晶型进行研发，可能会在临床后期发生晶型的变化，从而导致药物延期上市而蒙受巨大的经济损失，如果上市后因为晶型变化而导致药物被迫撤市，损失就更为惨重。因此，药物晶型研究和药物固态研发在制药业具有举足轻重的意义。
由于药物晶型的重要性，美国药监局(FDA)和中国药监局(SFDA)在药物申报中对此提出了明确规定，要求对药物多晶型现象进行研究并提供相应数据。正因如此，任何一个新药的研发，都要进行全面系统的多晶型筛选，找到尽可能多的晶型，然后使用各种固态方法对这些晶型进行深入研究，从而找到最适合开发的晶型;选定最佳晶型后，下一步就是开发能始终如一生产该晶型的化学工艺;最后一步是根据制剂对原料药固态性质的要求，对结晶工艺进行优化和控制，确定生产具有这些固态性质的最佳工艺参数，从而保证生产得到的晶型具有理想的物理性质，比如晶体表象，粒径分布，比表面积等。这种通过实验设计来保证质量的方法必须对药物晶型具有非常全面深刻的理解才能实现。
原研药公司对药物分子的晶型申请专利，可以延长药物的专利保护，从而使自己的产品具有更长时间的市场独享权。而对于仿制药公司来说，为了确保仿制药和原研药在生物利用度上的等同性，也需要对原料药的晶型进行研究，以确保原料药和制剂的质量，正因为如此美国药监局在ANDA申报中也对仿制药多晶型控制有明确的指南;另外，开发出药物的新晶型从而能够打破原研药公司对晶型的专利保护，提早将仿制药推向市场，也是近年来仿制药公司一个至关重要的策略，而且如果能找到在稳定性，生物利用度，以及生产工艺方面具有优越性的新晶型，还可以申请晶型专利保护，从而

大大提升自己的市场竞争力。总之，不管是新药开发，还是仿制药生产，药物晶型研究都是必不可少的中心环节。
目前鉴别晶型主要是针对不同的晶型具有不同的理化特性及光谱学特征来进行的，现将几种常用且特征性强、区分度高的方法介绍如下，以供参考。
1X-射线衍射法(X-raydiffraction)
X-射线衍射是研究药物晶型的主要手段，该方法可用于区别晶态和非晶态，鉴别晶体的品种，区别混合物和化合物，测定药物晶型结构，测定晶胞参数(如原子间的距离、环平面的距离、双面夹角等)，还可用于不同晶型的比较。X-射线衍射法又分为粉末衍射和单晶衍射两种，前者主要用于结晶物质的鉴别及纯度检查，后者主要用于分子量和晶体结构的测定。
1.1单晶衍射
单晶衍射是国际上公认的确证多晶型的最可靠方法，利用该方法可获得对晶体的各晶胞参数，进而确定结晶构型和分子排列，达到对晶型的深度认知。而且该方法还可用于结晶水/溶剂的测定，以及对成盐药物碱基、酸根间成键关系的确认。然而，由于较难得到足够大小和纯度的单晶，因此该方法在实际操作中存在一定困难。
1.2粉末衍射
粉末衍射是研究药物多晶型的最常用的方法。粉末法研究的对象不是单晶体，而是众多取向随机的小晶体的总和。每一种晶体的粉末X-射线衍射图谱就如同人的指纹，利用该方法所测得的每一种晶体的衍射线强度和分布都有着特殊的规律，以此利用所测得的图谱，可获得出晶型变化、结晶度、晶构状态、是否有混晶等信息。该方法不必制备单晶，使得实验过程更为简便，但在应用该方法时，应注意粉末的细度，而且在制备样品时需特别注意研磨过筛时不可发生晶型的转变。
2红外吸收光谱法
不同晶型药物分子中的某些化学键键长、键角会有所不同，致使其振动-转动跃迁能级不同，与其相应的红外光谱的某些主要特征如吸收带频率、峰形、峰位、峰强度等也会出现差异，因此红外光谱可用于药物多晶型研究。目前已知的由于晶型不同引起红外光谱不同的药物有甲苯咪唑等20多个品种。红外光谱法常用的样品制备方法有KBr压片法、石蜡糊法、漫反射法以及衰减全反射法(attenuatedtotalreflection,ATR)等。考虑到研磨可能会导致药物晶型的改变，所以在用红外光谱法进行药物晶型测定时多采用石蜡油糊法，或采用扩散反射红外傅里叶变化光谱法(DRIFT)。近些年来，随着计算机及分析软件的发展，近红外傅里叶变换拉曼光谱法(NIR-FTRS)也应用在药物多晶型的定性、定量研究中，它融合了NIR速度快、不破坏样品，不需试剂、可透过玻璃或石英在线测定的优势[6]和拉曼

光谱不需专门制备样品以及对固体药物晶型变化灵敏的特点，可视为传统红外光谱法研究药物多晶型的一种延伸。红外光谱法较为简便、快速，然而对于部分晶型不同而红外图谱相同或差别不大的药物，红外光谱就难以区分了，如苯乙阿托品的晶型I和晶型II的红外光谱一致;而且有时图谱的差异也可能是由于样品纯度不够，晶体的大小，研磨过程的转晶等导致的分析结果偏差。这时就需要同时采取其他方法共同确定样品的晶型。
3熔点法和显微镜法
如上所述，药物晶型不同，熔点可能会有差异，除常见的毛细管法和熔点测定仪方法外，热载台显微镜也是通过熔点研究药物多晶型存在的常见方法之一，该方法能直接观察晶体的相变、熔化、分解、重结晶等热力学动态过程，因此利用该工具照药典规定进行熔点测定可初步判定药物是否存在多晶现象。部分药物多晶型之间熔点相差幅度较小，甚至无差别，故以熔点差异确定多晶型，只是初步检测方法之一。一般来说，晶型稳定性越高熔点也越高;两种晶型的熔点差距大小，可以相对地估计出它之间的稳定性关系。如果两种晶型熔点相差不到1℃时，则这两种晶型在结晶过程中就可以同时析出，且两者的相对稳定性较难判别。两者熔点越接近，不稳定的晶型越不易得到。
4热分析法
不同晶型，升温或冷却过程中的吸、放热也会有差异。热分析法就是在程序控温下，测量物质的物理化学性质与温度的关系，并通过测得的热分析曲线来判断药物晶型的异同。热分析法主要包括差示扫描量热法、差热分析法和热重分析法。
DSC是在程序控制下，通过不断加热或降温，测量样品与惰性参比物(常用α-Al2O3)之间的能量差随温度变化的一种技术。DSC多用于分析样品的熔融分解情况以及是否有转晶或混晶现象。
DTA和DSC较为相似，所不同的是，DTA是通过同步测量样品与惰性参比物的温度差来判定物质的内在变化。各种物质都有自己的差热曲线，因此DTA是物质物理特性分析的一种重要手段。
TGA是在程序控制下，测定物质的质量随温度变化的一种技术，适用于检查晶体中溶剂的丧失或样品升华、分解的过程，可推测晶体中含结晶水或结晶溶剂的情况，从而可快速区分无水晶型与假多晶型。热分析法所需样品量少，方法简便，灵敏度高，重现性好，在药物多晶型分析中较为常用。
5偏光显微镜法
偏光显微镜除了含有一般光学显微镜的结构外，最主要的特点是装有两个偏光零件，即装在载物台下方的起偏镜(又称下偏光镜)和装在镜筒中的分析镜(又称上偏光镜)。两镜均由人工合成偏光片组成，通过角度的调整，可将

射入光源转换成正交偏光。正因为如此，该方法主要适用于透明固体药物。透明固体药物的观测一般是在正交偏光下进行。由于晶体结构不同和偏光射入时的双折射作用，在偏光显微镜上、下偏光镜的正交作用下，晶体样品置于载物台上旋转360ordm;时，则晶体显现短暂的隐失和闪亮，晶体隐失时晶体与偏振器振动力向所成的交角称为消光角，通过不同的消光角，即可决定晶体所属的晶型。偏光显微镜法还可研究晶型间的相变，可以准确测定晶体熔点;对于具有各项向异性的动植物材料(如纤维蛋白、淀粉粒)的结构，具有特殊的鉴定作用。
6核磁共振法
不同晶型结构中分子中的原子所处化学环境存在细微差异，类似核对施加的外磁场即产生不同的响应，致使类似核在不同化学位移处发生共振，因此其13C-NMR谱图不同，通过对不同晶型图谱的对比，即可判断药物是否存在多晶现象，通过与已知晶型的13C-NMR比较，也可获得测试样品的具体晶型。尤其是近年来出现的固态13C-NMR、高效质子去耦合、交叉极化(CP)、幻角自旋(CAS)等新技术的应用，使得我们能获得高分辨率的13C-NMR谱，这种谱图能给出有关动力学和局部化学环境的详细原子水平的信息，因此利这种高分辨率的13C-NMR谱图可进行多晶型的混晶分析以及某种特征晶型的测定。
7扫描隧道显微镜法
扫描隧道显微镜可使人类能够直接观察到晶体表面上的单个原子及其排列状态，并能够研究其相应的物理和化学特性;可以直接观测晶体的晶格和原子结构、晶面分子原子排列、晶面缺陷等。因此STM用于药物多晶型研究非常有利，具有广阔的应用前景。
8溶解度方法
如前所叙，药物的不同晶型的自由能不同，导致了其溶解度不同，一般说来，自由能越大，晶型越不稳定，溶解度越大;反之则小。在实践中常测定各晶型再不同温度下的溶解度，并绘制出溶解度(Cs)-温度(T)曲线。通过测定Cs-T曲线，可以区分出不同的晶型，如有相交的曲线，还可得到其热力学转变温度(Tp)
9药物多晶型计算机辅助预测
近年来，随着计算机技术的发展，计算机辅助预测药物晶型也有了较大进展。例如，在固体药物结构已知的前提下，运用商业程序PolymorphPredictor,通过计算点阵能量最小化方法寻找能量上可能的晶体结构和分子排列规律，并将它们按能量大小排列，计算出不同洁净条件下的最可能生成的晶型。但该方法在药物中的成功率目前还较低。
10其他
除上述常见的的几种方法外，还可根据不同晶型药物因分子或原子在晶格空间排列不同所导致在密度、折射率、吉布斯自由能等方面的差异，通过测定药物的密度、折光率或

采用磁性异向仪和膨胀计等仪器进行不同晶型的确定;对于存在色多晶型药物，还可通过观察药物的颜色，推测药物动物晶型。另外随着科学技术的进步，随着对化学物质细微结构认识的加深，相信还会有新的技术手段可用于药物晶型的研究。
11结语
上述所提及的药物晶型确定方法多数仅能反映药物不同晶型某一方面的物理性质，因此，不同测试手段的综合运用，可达到对药物晶型的全面认识。近年来出现的红外与热显微镜法，以及差示扫描量热法与热台显微镜法联用方法即是该思路的一种体现。
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"同样的化学药物，为什么有的厂商的产品效果好，另外厂商的产品效果就差不少?"临床上，这个问题困扰过不少医生和患者。在日前举行的中国医学科学院药物研究所药物晶型研究中心成立暨晶型药物研讨会上，与会专家告诉公众，这种药效差异有可能是药物晶型不同造成的。
专家指出，在药物原料成分、化学纯度等都达到国际标准要求的背景下，药物晶型是影响我国仿制药物质量水平的主要因素。
不同晶型药物疗效相差数倍
中国医学科学院药物研究所药物晶型研究中心主任吕扬说，晶型是物质的存在形式。物质都是以特定的分子或原子排列方式存在的，相同的元素由于排列方式不同，形成了物质的不同特性。例如，金刚石和石墨，都是由碳元素组成，前者坚硬无比，而后者却松软似粉;绵白糖和冰糖的基本成分都是蔗糖，前者易于溶解，后者溶解缓慢，其原因都是由于晶型的差异。
"药品也存在多晶型现象。如果因晶型不同，药物的吸收、疗效、质量也会出现不同，这样的药物就可以称为晶型药物。"吕扬说，晶型药物的研究应涵盖所有固体药物，包括化学药、生物药、植物药，不仅包括片剂、胶囊等口服固体药物，还包括粉针剂等固体注射制剂以及悬浮剂等。
据介绍，在《美国药典》(30版)中，规定了晶型检查的药物品种193种。在《欧洲药典》(5版)中规定了晶型检查的品种共103种。而在《中国药典》(2005版)中，规定了晶型检查的品种有2种，仅占总数的0.3%.
记者在采访中了解到，1995年，我国首次发现了治疗脑血管疾病的仿制固体药物尼莫地平的多晶型现象。研究发现，一种国产尼莫地平的生物利用度约为进口药的1/3，原因正是晶型不同。"这就意味着，吃3片这种国产尼莫地平，才顶得上1片进口尼莫地平的效果。"不仅如此，药物晶型研究中心学术委员会主任委员

、中国医学科学院药物研究院副院长杜冠华教授透露，即便是同一种药物，不同厂家生产或者同一厂家生产的不同批号的药品，由于其药物晶型未控制好，临床疗效也存在显著差异。
据介绍，杜冠华所带领的研究团队曾经就16家国内企业的尼莫地平生物等效性进行评价，发现不同厂家该产品的最大血药浓度参差不齐，最多相差可达5倍;对24家国产的罗红霉素进行生物效应分析显示，不同厂家固体制剂的最大血药浓度相差近1倍。"抗菌药物的最大血药浓度如果没有达到最小抑菌浓度，非但杀不死细菌，低剂量长时间的使用反而会造成耐药现象。药物晶型的研究，就是要寻找到稳定性最好、临床疗效最佳、安全性最高、最适合用于制备药品的晶型状态。"杜冠华说。
我国晶型药物研究明显滞后
杜冠华坦言，从1985版《中国药典》开始收载第一个晶型药物--棕榈氯霉素起，5年后增加了第二个晶型药物广谱驱虫药甲苯咪唑，15年后，2005年版《中国药典》中仍然保持着这一数字。由此可见，在晶型药物成为国际研究热点，并迅速发展的年代，我国在此领域基本处于停滞状态。
记者在翻阅药典时发现，杜冠华所提及的广谱驱虫药甲苯咪唑，共包括A、B、C三种晶型，其中，A型为无效晶型，B型会造成原料中有毒有害物质超标，而只有C型可以作为药用晶型。由于A型和C型的混合晶型物质很难纯化分离，当A型物质超过30%时，其药物临床疗效会急剧下降，因此，我国药典就A型物质量进行了限制，即原料药中A型物质不得超过10%.
吕扬坦言，并非目前我国药典中收录的药物不存在晶型问题，比如公众熟知的抗菌药物阿莫西林、罗红霉素，降压药物卡托普利，血管扩张药物葛根素，抗惊厥和镇痛药物卡马西平等，在欧美国家药典上均标注了对晶型的要求，而我国药典甚至没有指出这些药品有多晶型现象，更不可能提出相关的晶型质量控制要求。对晶型质量控制的手段，我国也明显滞后。"《美国药典》对晶型纯度和质量控制的检测方法中扩展了X射线衍射法，而我国药典仅停留在了红外光谱进行晶型定性或半定量的检测方法。"
软硬件均需加强
"现阶段我国晶型药物研究绝大多数仍处于自发状态。"杜冠华坦言，虽然我国在"十一五"期间已经将药物晶型作为关键技术立项研究，但目前我国仅有少数研究机构从事晶型药物研究，同时，掌握晶型药物专业技术的科研人员更为稀缺，相关政策法规也有待完善。
据介绍，2007年7月，美国食品药品监督管理局已经颁布《仿制药晶型研究的技术指导原则》，同时，明确提出，由于不同晶型的原料药只是物理特征不同，化学

结构相同，因此可以简化申请流程，只要求证实新晶型药物的生物等效性、稳定性等，即可获得批准。
"而在我国，《药品管理法》和《药品注册管理办法》还没有针对晶型药物进行分类管理的具体规定，而在药品审评过程中，针对申请注册的晶型药物审评也要求不一，这主要是由于对晶型的科学认识不足造成的。"杜冠华说。
据介绍，自1985年以来，在我国申报药物晶型相关专利共1182件，仅2005年~2009年，就申请专利714件。国外药厂凭借药物晶型申请专利，持续占领新药市场。例如，全球年销售量超过10亿的药物中，辉瑞公司的阿奇霉素已申领了18个晶型专利，涉及晶型物质的制备工艺过程技术、鉴别和检测分析技术、制剂技术等。
杜冠华建议，现阶段我国在多晶型药物的研发方面，首先要提高对晶型药物研究的认识，提高我国晶型药物研发水平;其次要完善和更新药品审评标准，制定科学合理并有利于科技进步的管理政策;此外，要针对药品生产企业制定关于晶型药物研究和生产的一整套管理规定和指南;最后要重点加强和完善《中国药典》中关于药物晶型的检测技术和标准，不仅要保证国产仿制药品的疗效，同时，还要依靠优势药物晶型进军全球新药市场。
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