实验七、质粒DNA的小量制备

实验七、质粒DNA的小量制备

一、实验目的

用碱性裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA。

二、实验原理

分离质粒DNA需要去除的：大肠杆菌染色体DNA、蛋白质、 RNA 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

该方法是在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经碱处理溶菌。

同时在pH高达12.0-12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

降解的小分子RNA可通过Rnase A处理去除，未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。

三、实验材料

LB液体培养基、氨苄青霉素、RNase A 、预冷无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液

溶液Ⅰ（细菌重悬液）：50mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH 7.5

溶液Ⅱ(细菌裂解液)：0.4M NaOH、2% SDS

溶液Ⅲ：1.32M KAc、pH 4.8 (用醋酸调)

四、实验具体步骤

1、挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp 100μg/ml），37℃，250rpm，培养过夜。

2、取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。

3、吸去上清，使沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

5、加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，轻柔颠倒5次以混匀内容物。冰上放置不超过5min。

6、加入200μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，温和振荡，冰上放置3-5min。

7、4℃，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管中。

8、重复步骤7。

9、加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃， 12,000rpm ，2min，将上清转移到另一离心管中。

10、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。

11、4℃，12,000rpm，5min。

12、弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

13、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸干，37℃干燥10min。

14、加入20μl RSW缓冲液（含20μg/ml RNase A ，不含DNA酶），使DNA完全溶解。

15、37℃，保温20min，消化RNA，取出置-20℃保存。

五、实验结果与分析

通过凝胶电泳检测抽提的质粒浓度及纯度。

根据迁移率，跑的最快的为共价闭合DNA，其次是线性DNA，最慢的是开环DNA。对比一下，DNA大多集中于共价闭合DNA中，说明制得的产物以共价闭合DNA为主，其中也含有开环DNA，但量较少。

六、思考题

问：溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中的作用分别是什么？

溶液I：重悬菌体，提供缓冲环境。

溶液II：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒。

溶液III：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀。