环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展

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应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌
术。
1 。从培养液中各取 1 L 2h 直接用试剂盒法提取各 m
菌基因组 D A N ,进行 Lm a p和 P R试验。 C 1 . 模板 D A的制备 .2 3 N 按 照 D A试剂盒 的说 明进行 ,提取 的 D A N N , 溶解于 10z 0/ L的洗脱缓 冲液 中,并储存在 一 0℃ 2 备用。 1 . 模板 D A含量的确定 .3 3 N 根据测定模板 D A稀释 1s N O倍后的 O 2 0 D 6 读 数, 计算 D A含量为 21 ×1“g / 。 N . 5 0 f/ L x 1. A P .4 3 L M 引物设计 根据 G nbn eeak中的阪崎肠 杆菌基 因序列 ,进 行 比对 ,确定阪崎肠杆菌 ( T C 94 ) G n ak A C 25 4 在 eB n
E L 3 、C C 4 8 8 D 93 M C 42 ;大肠 艾 希 氏菌 ( . o) E cl : i C MC 12;沙门氏菌 ( m nl) MC 4 05 G C129 s oea:C C 7 0 、 l a l
源性达到 9%。用 2 株食源性 致病菌证 实 9 5 该引物特异性强。L M 扩增 2 mn A P 0 i,其灵敏度为 4 × 0 f/ b , . 12g t e 3 u 结果表明,L M A P方法检测阪崎肠杆 菌,灵敏度高、特异性强、耗 时短 、方法简便。 关键词 环介导等温扩增 ;L M ;检测 ;阪崎肠杆菌 A P
L AMP wa o iv . h oi w ̄ rd cswee dg se t e t cin e zme whc h h oeia x e td sp s ie T e p st p o u t t i r ietd wi rsr t n y , h i o ih te te rt l e p ce c

环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展

环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展

环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【摘要】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型核酸检测技术其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增,与传统核酸检测技术(PCR法、实时荧光定量PCR法)相比,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、可肉眼判读结果等优点核酸检测是食品安全检测技术的一个重要手段,本文综述了LAMP技术在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测和动物源性成分检测领域的应用研究进展,探讨了LAMP技术在食品检测领域的发展前景,以期为食品快速、高通量检测技术建立提供参考%loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method developed in recent years.The nucleic acid amplification is performed ender isothermal conditions by a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement pared with the traditional nucleic acid detection technology (PCR and real-time fluorescence quantitative PCR),it has the advantages of easy operation,high specificity,sensitivity and visual interpretation.Nucleic acid detectiou is an important means of food safety detection.This review summarized the application research progresses mainly focused on food safety detection,including food microorganisms testing,genetically modified organisms testing,food allergens testing and food derived ingredients testing.In addition,the perspectives of LAMP in food detectiou were discussed for better and high volume testing in food safety detection.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】5页(P330-334)【关键词】环介导等温扩增技术(LAMP);食品安全;检测;核酸扩增【作者】范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【作者单位】广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300【正文语种】中文【中图分类】TS207.3核酸扩增是分子生物学研究领域的一项重要技术,目前已广泛应用于医学诊断、食品检测、动植物检验检疫等行业中。

重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进展

重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进展

重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进

毛迎雪;刘蒙达;张皓博;曲瑶;南文龙;苏华彬;刘建柱;孙淑芳;胡莉萍;樊晓旭
【期刊名称】《中国动物检疫》
【年(卷),期】2024(41)1
【摘要】重组酶介导等温扩增(RAA)是一种恒温快速核酸扩增技术,是重组酶等温扩增技术中具有代表性和前沿性的检测技术,其弥补了现有核酸体外扩增技术需要热循环的局限性,使得核酸体外扩增更加简便快捷,目前已被广泛应用于动物疫病检测。

本文介绍了RAA技术的检测原理、引物探针设计及优缺点,综述了其在病毒、细菌、寄生虫及抗生素耐药基因检测等方面的应用进展,总结了国内现有RAA技术标准及检测产品开发情况,以期为拓展RAA技术的应用提供参考。

【总页数】7页(P60-66)
【作者】毛迎雪;刘蒙达;张皓博;曲瑶;南文龙;苏华彬;刘建柱;孙淑芳;胡莉萍;樊晓旭【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心;山东农业大学动物科技学院;青岛农业大学动物医学院;山东省动物疫病预防控制中心
【正文语种】中文
【中图分类】S851.3
【相关文献】
1.环介导等温扩增技术在病原微生物检测中的应用进展
2.环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物检测中的应用研究进展
3.环介导等温扩增技术在畜禽病原
微生物检测中的应用及进展4.环介导等温扩增技术在病原微生物快速检测中的应用研究进展5.重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展
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用环介导等温扩增方法检测牛奶中致病微生物

用环介导等温扩增方法检测牛奶中致病微生物
5. 仪器与设备: 生化培养箱, 购自上海新苗医 疗器械制造有限公司。 拍击式均质器, 西班牙 IUL 公 司。 灭菌器, 山东省新华医疗器械股份有限公司。
(二) 方法 1. 准确度试验。 取牛奶样品 20 份, 随机加入 培养的沙门氏菌悬液 4~6 份, 混匀后取样, 增菌 后 用 沙 门 氏 菌 核 酸 LAMP 检 测 试 剂 盒 进 行 检 测 , 同 时 采 用 GB 4789.4-2010 《 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 沙 门 氏 菌 检 验 》 [7]进 行 检 测 。 比较检测试剂盒和国家标准方法的结果。 沙 门 氏 菌 核 酸 LAMP 检 测 试 剂 盒 检 测 方 法 : 样本前处理、 增菌按照国家标准方法进行。 取增菌 液 200 μL 加到 1.5 mL 无菌离心管中, 14 000 r/min 离 心 2min, 弃 上 清 液 。 加 入 80 μL DNA 提 取 液 , 重 悬 菌 体 , 95℃孵 育 10 min; 14 000 r/min 离 心 2 min, 中层透明液体即为核酸模板。 加 22.5 μL 复溶液到冻干 LAMP 反应体系中, 加 30 μL 石蜡油, 加入 2.5 μL 模板到上述反应体 系 中 , 65℃恒 温 反 应 60 min。 反 应 管 颠 倒 约 停 留 5s, 使 反 应 液 与 显 色 液 (显 色 液 在 盖 中 ) 充 分 混 合, 观察结果。 反应管绿色为阳性, 橙色为阴性。 副溶血性弧菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠埃希氏 菌 O157、 志贺氏菌、 单增李斯特菌的检测分别采 用 对 应 的 核 酸 LAMP 检 测 试 剂 盒 和 国 家 标 准 , [8~12] 其他试验方法同上。 2. 重复性试验。 取同一污染的牛奶, 分别用 3 个批次试剂盒重复检测 5 次, 记录检测结果。 3. 灵敏度试验。 将培养的沙门氏菌进行 10 倍 梯度稀释成 5 个浓度, 加到经过检测的沙门氏菌阴 性的牛奶中, 混匀取样增菌。 用沙门氏菌核酸LAMP 检测试剂盒进行检测, 同时采用 GB 4789.4-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌 检验》 进行检测。 比较检测试剂盒和国家标准方法

滚环扩增介导的核酸信号放大策略在生物传感器中的应用研究进展

滚环扩增介导的核酸信号放大策略在生物传感器中的应用研究进展

第39卷第12期2020年12月分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)Vol.39 No.121556-1560d o i: 10.3969/j.issn.1004 -4957. 2020.12. 019滚环扩增介导的核酸信号放大策略在生物传感器中的应用研究进展刘巨,梁涛波,许恒毅*(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌333047)摘要:滚环扩增(RCA)是一种等温核酸扩增技术,因其具有扩增效率高、保真度高等特点,在生物传感器领域得到了广泛的应用。

该文介绍了 R C A技术的基本原理、R C A环状模板环化方式和R C A的扩增类型,并对基于R C A技术的荧光、比色以及电化学生物传感器进行了介绍,旨在为R C A技术在生物传感器领域的进一步发展和应用提供参考。

关键词:等温核酸扩增;滚环扩增;生物传感器中图分类号:O657.1;G353.11文献标识码:A文章编号:1004 -4957(2020)12 -1556 -06A d v a n c e s o n A p p l i c a t i o n o f R o l l i n g C i r c l e A m p l i f i c a t i o n-m e d i a t e d N u c l e i c A c i dS i g n a l A m p l i f i c a t i o n S t r a t e g y i n B io s e n s o r sL I U J u,L IA N G T a o-o,X U H e n g-y i*(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang330047,China)A b s t r a c t:R o llin g c irc le a m p lific a tio n(R C A)is an isotherm al n u cle ic acid a m p lific a tio n te c h n iq u e.D ue to its h igh e ffic ie n c y and h igh f id e lit y,th is te ch niq ue has been w id e ly used inreview rntroduces the p rin c ip le o f R C A te c h n iq u e,the com m on cycliz a tio n types o f R C A tem plate andthe com m on types o f R C A,as w e ll as the flu o re s c e n t,c o lo rim e tric and electroch em ica l biosensorsbased on R C A.The aim o f th is review is to p ro vid e references fo r the fu rth e r developm ent and a p p li­catio n o f the R C A te ch niq ue in biosensors.K e y w o rd s:isotherm al n u c le ic acid a m p lific a tio n;ro llin g c irc le a m p lific a tio n;biosensor近年来,基于分子生物学的检测技术被广泛应用于生物传感器领域,其中包括P C R(P o ly m e r scha in re a c tio n)技术、滚环扩增(R C A)技术、环介导恒温扩增(L A M P)技术、杂交链式反应(H C R)技术、重组酶聚合酶扩增(R P A)技术和链置换扩增(S D A)技术等。

LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用论文

LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用论文

LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用【摘要】目的:探讨副溶血性弧菌属(vibrio parahaemo lyticus, vp)环介导等温扩增(lamp)在食源性食物检测中的应用价值。

方法:利用文献报道的lamp检测方法和分离培养法分别对12类286份食源性食品标本进行副溶血性弧菌检测;检测结果经统计学分析来评价lamp法和分离培养法的差异性。

结果:lamp 法从64份动物性水产标本中检出44份副溶血性弧菌阳性菌株,阳性率为68.75%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;国标法从64份动物性水产标本中检出33份副溶血性弧菌阳性菌株,阳性率为51.6%。

两种方法的检测结果经统计学分析,p<0.005,结果有显著性差异,lamp法阳性率高于培养法。

lamp法可在24小时内从食品中检测出副溶血性弧菌,而国标法检出副溶血性弧菌需要4-7天,lamp法更快速。

结论:副溶血性弧菌属lamp法检测阳性率高于国标法,lamp法可用于食源性食物副溶血性弧菌属的快速检测。

【关键词】环介导等温扩增;副溶血性弧菌属;食源性;检测【中图分类号】r155 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484(2012)13-0555-02随着生活水平的不断提高,食源性食物的安全越来越受到全社会和政府各级部门的高度重视与关注,而与食源性食物安全相关的微生物检测已成为食品保障的重要措施之一[1]。

用lamp法可以快速、简便、准确的检测出食源性食物中致病性微生物,大大缩短检测时间,提高致病性微生物的检出率,为致病性微生物的分离培养提供指导方向和科学依据。

副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎和食物中毒的一种重要的食源性致病菌,在海水产品中其感染水平可达80%[2],在细菌性食物中毒中,由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。

传统的副溶血性弧菌国标法[4]检测时间长,检出率低,不宜快速出结果。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)技术[7]是一种新型等温核酸扩增方法,针对靶基因设计4-6条引物,利用一种具有链置换活性的bst dna聚合酶,在恒温条件(60-65 ℃)保温约 60 分钟,即可完成核酸扩增反应,产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状dna混合物,副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。

PCR技术在常见食源性致病菌中的研究进展

PCR技术在常见食源性致病菌中的研究进展

PCR技术在常见食源性致病菌检测中的研究进展食品安全是直接关系到人民群众生命、健康和社会稳定的重大公共安全问题,而食源性致病菌是影响食品安全的主要因素,因此,检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节。

传统的微生物检测方法主要包括细菌的分离培养和生化鉴定等,在实际检测中周期较长,步骤繁琐且工作量大,不能实现及时有效的监测。

因此,采用快速、准确而简便的食源性致病菌鉴定方法已成为食品安全质量控制中重要问题。

随着分子细菌学研究的不断进行,人们对细菌的毒素、侵袭素和毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测也从表型特征鉴定逐渐向遗传特征鉴定。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术作为近年来发展起来的一种分子生物学技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点,在食源性致病菌的检测方面正发挥着越来越重要的作用。

1 PCR技术简介及原理PCR技术是1985由Mullis等人创立的一项体外核酸扩增技术。

其基本原理就是在体外适宜条件下,以单链DNA为模板,以人工设计与合成的寡核苷酸为引物,利用热稳定的DNA聚合酶按5’~3’方向掺入单核苷酸来特异性地扩增DNA片段。

2 几种常见食源性致病菌的PCR研究进展2.1 沙门氏菌沙门氏菌属(Salmonella) 是肠杆菌科中最重要的病原菌属,在世界各地的食物中毒中,沙门菌食物中毒常占首位或第二位[1],目前共发现2541个血清型。

很多学者从上个世纪90年代就开始尝试利用PCR技术检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌[2-3]。

目前,用于PCR检测的靶基因主要包括16S rRNA基因、invA、invB 、invC 、invD 、invE 、hilA、fimA、stn、rfb、agfA、viaB以及与质粒毒力相关的SPV基因等。

其中invA基因是毒力岛SP11基因之一,是产生致病性的关键因子,因此常用来作为PCR检测沙门氏菌的靶基因。

环介导恒温扩增法检测肉制品中致病微生物

环介导恒温扩增法检测肉制品中致病微生物

摘 要 : 目的 :建 立一种 食 品中微生物 核酸快速 检测 技术 ,在此 基础上 开发 的简 便 、快速 、灵敏 ,不依赖仪器 适 合基层应 用的核酸快速 检测试剂 盒 ;并探 索该试剂盒 在 肉及 肉制 品微生物检 测 中的应用 。方法 :根据 单核细胞 增 生李斯特 氏菌特有 的靶序列 vrR基 因设计 引物,采用 环介导恒温 扩增技 术构建检 测体系 ,优化 、验 证检测 的 i
关键 词 :恒温 核酸扩 增 ;环介 导恒温 扩增 ( AMP ; 肉制 品;微 生物 ;食 品安全 L )
Ra i t c i n o s e i n c t g n si e t r d c i g Lo p M e it d Io h r a p dDe e t f tra mo o y o e e M a o u t o Li n P Usn o — d ae t e m l s Amp i c t nM e o l a o t d i f i h
r s l o t e l td s e i s T el t f e c i n wa . 1 × 1 CF mL. dt es n i v t s o ss n t a e u t f r h r e ae p c e . h mi o t t s 18 s o r i de o 0 U/ n a e st i wa n it t h t t h i y c e wi h o e c n e t n t o s Ot e d a tg ss c ssmp e a d r p d d t ci n a d f w e d o n t me t r S ft o v n i a me d . h ra v a e u h a i l n i ee t n e n e sf ri s u n swe e a O h ol h n a o r l a h e e , e e yd s r i g t ep p l rz d c iv d t rb ee vn b o uaie . h o
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作者简介:李秀桂(1965一),男,广西贵港市人,副主任技师,主要从 事食品卫生微生物检验与研究工作。
1/2—1/3。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度 进行判断是否发生反应。LAMP技术具有高特异性、 高效率和便捷等特点141。 1.2引物设计LAMP引物的设计比常规PCR要 复杂。一个反应至少包括4条引物,包括一对内引物 (FIP和BIP)和一对外引物(F3和B3);外部引物限 定了扩增片段的大小范围,同时也为内部引物提供 了模板,如果再增加一对环引物(100p primer),会明 显加快等温扩增的速度,大大提高检测效率,检测率 比没有加环引物的高7个数量级15,61。国外已建立
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要的食源性致病菌,感染导致肠炎疾病,发病率呈逐 年上升趋势。副溶血性弧菌致病因子是其携带的tdh 和tdl编码毒力基因,采用常规检测方法无法解决风 险监测和评估。徐芊等“7首次报道了利用LAMP技 术检测副溶血性弧菌,针对副溶血性弧菌不耐热溶 血素基因(tlII)设计4条特异引物进行LAMP扩增, 对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应 温度为60℃,特异性为100%,且副溶血性弧菌基因 组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为90fg和 24cfu/mL,对模拟样品检测,检测限为89cfu/g,整个 过程l小时能完成检测。 2.5阪崎肠杆菌检测2002年国际食品微生物标 准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为“严重危害 特定人群,危害生命或慢性实质性后遗症或长期影 响”致病菌[181,该菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌 血症和坏死性小肠结肠炎,并可能遗留严重的神经 系统后遗症,死亡率20%一50%It9 Jo贺楠等∞参照 阪崎肠杆菌标准株(ATCC51329)16SrRNA基因设计 4条特异性引物。方法最低检测限可达到 0.3pgDNA,当稀释度105时才检测不到扩增产物,而 PCR方法稀释度102时就检测不到扩增物。而胡莲 霞m1则以16S。23S rRNA间区序列作为靶序列,采 用带有2条环引物(LF和LB)的改良LAMP方法检 测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌,灵敏度为 0.101cfu/mL,人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉 的检出限为1.1efu/g,而对照PCR方法检测阪崎肠 杆菌的灵敏度为101cfu/mL,人工污染阪崎肠杆菌的 婴儿配方奶粉的检出限为1 100 cfu/g,改良LAMP 方法比较PCR方法,其灵敏度提高了l 000倍,检测 耗时仅为l~3h。 2.6金黄色葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌是一 种常见的致病菌,导致感染性疾病是其产生的肠毒 素造成的,且耐药性金黄色葡萄球越来越广泛。申 建维等勉荆用多重LAMP法同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因mecA和femA,在反应过程中,两种分子 信标荧光探针分别与mecA和femA基因的扩增产物 序列互补结合,最后检测反应管中的两种荧光值。 结果显示该方法的检测下限为10cfu/mL,与传统的 M2H培养基苯唑西林药敏实验结果比较,灵敏度为 99.9%,特异度为90.9%。适用于直接快速检测临 床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 2.7单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李 斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致 病菌,WHO已将其列为20世纪90年代食品中四大
万方数据
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致病菌之一。主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、 流产、无败血症性单核细胞增多症等,尤其是免疫力 低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病。在 单增李斯特氏菌中,hlv基因编码的、能够结合胆固
O,呦), 醇并被巯基活化的李氏溶血素(Listeriolysin
是单增李斯特氏菌最主要的致病因子,也是致病性 李斯特氏菌普遍存在的毒力基因,是其毒力标志基 因,在李斯特菌中是保守且特有的。袁耀武等∞I以单 核细胞增生性李斯特氏菌的李氏溶血素基因(Hly)为 靶基因,针对其中的M24199基因设计4条LAMP反 应的引物,并采用FTA滤膜技术提取模板DNA,通过 优化的LAMP反应条件,成功地建立了检测单增李斯 特菌的LAMP方法。其敏感性检测限为7.3×10lcm/ mL,特异性检出限为8.9 X 10'cfu/g。 2.8蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌是最常见的食源 性病原菌,主要污染蛋白质和碳水化合物含量丰富 的食品(如奶制品、肉类、米饭、鱼、烧鸡等),属条件 致病菌,其症状表现为腹泻和呕吐,传统方法检验需 时4天。齐哲等圳利用蜡样芽孢杆菌溶血素基因的 hblA基因的保守序列设计LAMP反应的引物,采用 FTA滤膜提取DNA,检测蜡样芽孢杆菌和人工污染 蜡样芽孢杆菌的消毒乳。LAMP方法的检出限为4.4 efu/mL,特异性为100%,与普通PCR方法相比,灵敏 度提高了lO倍,人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的 检出限为57 cfu/mL。LAMP扩增可在20 min内完成, 对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测可在2Il内完成。 2.9产肠毒素性大肠埃希氏菌产肠毒索性大肠埃 希氏菌(E1EC)是食源性重要的致腹泻致病菌,产肠 毒素性大肠埃希氏菌的耐热肠毒素(sT)及不耐热肠 毒素(LT)是其引发腹泻的主要毒素。占利等{251参考 肠毒素性大肠埃希氏菌标准菌株CMCC44814的LT I 毒素基因,设计了6条反应引物(LTI—F3、LTI—B3、 LT I—FIP、LT I—BIP、LT I—LF、LT I—LB),其LAMP 检测的特异性为100%,灵敏度为1.09×102cfu/mL, 比较普通PCR法(1.09×103 cfu/mL)高出10倍。检测 时间仅需lh。 2.10香港海欧菌香港海鸥菌首次于2001年在香 港一患者血液中分离出,是一种新发现的食源性致 病菌,可引起细菌性急性腹泻,受到广泛关注。2007 年美国学者Marcos等嘶1将香港海鸥菌与产肠毒素脆 弱类杆菌、产酸克雷伯杆菌同列入2004~2007年间 新发现的3种引起人类急性细菌性腹泻的病原体。 目前国内没有香港海鸥菌的检测标准方法。朱敏等
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·综述·
ห้องสมุดไป่ตู้
文章编号:1673—758x(20lO)仇一0060一04
中图分类号:R155.5
文献标识码:A
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
李秀桂综述,刘 巍审校 广西壮族自治区疾病预防控制中心(南宁530028)
食源性疾病与食品污染构成了一个巨大并不断 扩大的世界性公共卫生问题。已知的食源性疾病大 约有250多种,主要包括致病菌、病毒和寄生虫导致 的感染性疾病。据统计,我国1992—2001年食源性 疾病的主要危害为微生物,占38.5%,以沙门氏菌、 副溶血性弧菌、变形杆菌等为代表引起的感染性疾 病患者是化学污染物引起疾病的2倍Ill。自2002年 起,我国建立了国家食源性病菌监测网络,开展监测 食品中沙门氏菌、出血性大肠0157:H7、副溶血性弧 菌、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、空肠弯曲菌7大类致病菌,为食品安全和 风险评估提供了科学依据。但目前食源性致病菌检 测仍然以传统经典的细菌分离、培养及生化鉴定为 主,耗时长,操作繁琐,受环境及主观因素影响大等; 生化快速鉴定方法和PCR检验等不仅需要价格昂 贵的设备,还需要较高的技术要求和资金投入,制约 了现场快速检测及基层实验室普及应用,影响检测 的时效性和准确性。2000年Notomi等12建立了一种 新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术。即 环介导等温扩增技术(100p—mediated isothermal an卜 plification,LAMP)。该技术具有特异性高,等温高效, 敏感性高,操作简便,反应不需PCR仪和特殊试剂, 产物易检测,不需繁琐的电泳,肉眼即可判断等优 点;现已广泛应用于对食源性致病菌的检测研究,大 有成为替代传统PCR检测技术的可能。本文就近年 来LAMP技术在食源性致病菌中快速检测的应用进 展做一综述。
2 LAMP方法在检测食源性致病菌的应用
2.1肠出血性大肠杆菌0157检测0157:H7是新 出现的出血性肠道病原菌,其毒素可引起结肠性出 血感染,并可导致血性腹泻或肾脏衰竭,是食源性疾 病重点监测细菌。2002年起,国家食源性疾病监测
万方数据
应用预防医学2010年2月第16卷第l期
网在许多监测点的食品中都有分离出0157:H7,说 明我国普遍存在0157肠道病原菌,但由于食品中 0157:H7含量极低,常规检测方法中需要0157免疫 磁珠捕获富集,才能提高0157检出率,此方法试剂
1环介导等温核酸扩增技术(“蚺口)
1.1 LAMP技术的原理该技术针对靶基因设计4 条特别引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温约6嘶lin,即 可完成核酸扩增反应,扩增出LAMP特征性梯状条 带;通过增加设计两条环引物还可使反应速度提升
了LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplor- er.Jp/e/),只要导入靶基因就能自动生成成组引物, 挑选最优组合即可。 1.3基本操作LAMP等温扩增反应体系包含了引 物、模板DNA、BstDNA聚合酶、dNTP和缓冲液。其基 本操作过程是将LAMP反应体系(除Bst DNA聚合 酶)在95℃加热5min,冷却后,加人Bst DNA聚合 酶,在60。65℃保温45~60min,然后在高于80℃的 温度下加温2min终止反应。 1.4 LAMP扩增结果判断扩增产物电泳后在紫外 灯下观察可见梯状条带,或直接用焦磷酸镁对扩增 产物沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检 测,也可用荧光染料SYBR GreenI染色,在紫外灯或 日光下通过肉眼进行判定,如果含有扩增产物,反 应混合物变绿;阴性结果则保持SYBR GreenI的橙 色不变171。2008年,Tomita等|8在Notomi的方法基础 上在LAMP反应体系中加入适量MgS04、MnCl2、 ca“,反应结果在白光下通过肉眼观察绿色钙锰复 合物是否生成进行辨别,比白色焦磷酸镁沉淀更易 于判断。
敏度达1%//2应,特异性100%;对牛奶样品中检出
限为102cfu/mL。鲁勇等“纠以鼠伤寒沙门菌的特异 invA基因为靶基因,能直接检测从感染标本以及沙 门菌菌落DNA提取物中检测沙门氏菌,阳性率为 100%,检测限达到102cfu/mL,2h内可完成检测。王 敏雅等“6也以沙门菌invA基因为靶基因,但通过对 反应温度、甜菜碱浓度进行初步优化,得到反应条件 为:扩增温度65cC,甜菜碱浓度1.0M条件下扩增效 率较高,成功检测32株不同血清型的沙门氏菌,阳 性率为100%。 2.4副溶血性弧菌检测 副溶血性弧菌是我国重
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