环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展

了ＬＡＭＰ引物设计的在线网站（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒ－ ｅｒ．Ｊｐ／ｅ／），只要导入靶基因就能自动生成成组引物， 挑选最优组合即可。 １．３基本操作ＬＡＭＰ等温扩增反应体系包含了引 物、模板ＤＮＡ、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ和缓冲液。其基 本操作过程是将ＬＡＭＰ反应体系（除Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合 酶）在９５℃加热５ｍｉｎ，冷却后，加人Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合 酶，在６０。６５℃保温４５～６０ｍｉｎ，然后在高于８０℃的 温度下加温２ｍｉｎ终止反应。 １．４ ＬＡＭＰ扩增结果判断扩增产物电泳后在紫外 灯下观察可见梯状条带，或直接用焦磷酸镁对扩增 产物沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检 测，也可用荧光染料ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ染色，在紫外灯或 日光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反 应混合物变绿；阴性结果则保持ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ的橙 色不变１７１。２００８年，Ｔｏｍｉｔａ等｜８在Ｎｏｔｏｍｉ的方法基础 上在ＬＡＭＰ反应体系中加入适量ＭｇＳ０４、ＭｎＣｌ２、 ｃａ“，反应结果在白光下通过肉眼观察绿色钙锰复 合物是否生成进行辨别，比白色焦磷酸镁沉淀更易 于判断。
２ ＬＡＭＰ方法在检测食源性致病菌的应用
２．１肠出血性大肠杆菌０１５７检测０１５７：Ｈ７是新 出现的出血性肠道病原菌，其毒素可引起结肠性出 血感染，并可导致血性腹泻或肾脏衰竭，是食源性疾 病重点监测细菌。２００２年起，国家食源性疾病监测
万方数据
应用预防医学ห้องสมุดไป่ตู้０１０年２月第１６卷第ｌ期
网在许多监测点的食品中都有分离出０１５７：Ｈ７，说 明我国普遍存在０１５７肠道病原菌，但由于食品中 ０１５７：Ｈ７含量极低，常规检测方法中需要０１５７免疫 磁珠捕获富集，才能提高０１５７检出率，此方法试剂
敏度达１％／／２应，特异性１００％；对牛奶样品中检出
限为１０２ｃｆｕ／ｍＬ。鲁勇等“纠以鼠伤寒沙门菌的特异 ｉｎｖＡ基因为靶基因，能直接检测从感染标本以及沙 门菌菌落ＤＮＡ提取物中检测沙门氏菌，阳性率为 １００％，检测限达到１０２ｃｆｕ／ｍＬ，２ｈ内可完成检测。王 敏雅等“６也以沙门菌ｉｎｖＡ基因为靶基因，但通过对 反应温度、甜菜碱浓度进行初步优化，得到反应条件 为：扩增温度６５ｃＣ，甜菜碱浓度１．０Ｍ条件下扩增效 率较高，成功检测３２株不同血清型的沙门氏菌，阳 性率为１００％。 ２．４副溶血性弧菌检测 副溶血性弧菌是我国重
６０
·综述·
文章编号：１６７３—７５８ｘ（２０ｌＯ）仇一００６０一０４
中图分类号：Ｒ１５５．５
文献标识码：Ａ
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
李秀桂综述，刘 巍审校 广西壮族自治区疾病预防控制中心（南宁５３００２８）
食源性疾病与食品污染构成了一个巨大并不断 扩大的世界性公共卫生问题。已知的食源性疾病大 约有２５０多种，主要包括致病菌、病毒和寄生虫导致 的感染性疾病。据统计，我国１９９２—２００１年食源性 疾病的主要危害为微生物，占３８．５％，以沙门氏菌、 副溶血性弧菌、变形杆菌等为代表引起的感染性疾 病患者是化学污染物引起疾病的２倍Ｉｌｌ。自２００２年 起，我国建立了国家食源性病菌监测网络，开展监测 食品中沙门氏菌、出血性大肠０１５７：Ｈ７、副溶血性弧 菌、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、空肠弯曲菌７大类致病菌，为食品安全和 风险评估提供了科学依据。但目前食源性致病菌检 测仍然以传统经典的细菌分离、培养及生化鉴定为 主，耗时长，操作繁琐，受环境及主观因素影响大等； 生化快速鉴定方法和ＰＣＲ检验等不仅需要价格昂 贵的设备，还需要较高的技术要求和资金投入，制约 了现场快速检测及基层实验室普及应用，影响检测 的时效性和准确性。２０００年Ｎｏｔｏｍｉ等１２建立了一种 新的体外扩增特异ＤＮＡ片段的分子生物学技术。即 环介导等温扩增技术（１００ｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎ卜 ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。该技术具有特异性高，等温高效， 敏感性高，操作简便，反应不需ＰＣＲ仪和特殊试剂， 产物易检测，不需繁琐的电泳，肉眼即可判断等优 点；现已广泛应用于对食源性致病菌的检测研究，大 有成为替代传统ＰＣＲ检测技术的可能。本文就近年 来ＬＡＭＰ技术在食源性致病菌中快速检测的应用进 展做一综述。
作者简介：李秀桂（１９６５一），男，广西贵港市人，副主任技师，主要从 事食品卫生微生物检验与研究工作。
１／２—１／３。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度 进行判断是否发生反应。ＬＡＭＰ技术具有高特异性、 高效率和便捷等特点１４１。 １．２引物设计ＬＡＭＰ引物的设计比常规ＰＣＲ要 复杂。一个反应至少包括４条引物，包括一对内引物 （ＦＩＰ和ＢＩＰ）和一对外引物（Ｆ３和Ｂ３）；外部引物限 定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供 了模板，如果再增加一对环引物（１００ｐ ｐｒｉｍｅｒ），会明 显加快等温扩增的速度，大大提高检测效率，检测率 比没有加环引物的高７个数量级１５，６１。国外已建立
昂贵、操作繁杂和耗时。２００３年Ｍａｒｕｙａｍａ等扣１人用 原位ＬＡＭＰ方法检测Ｅｃｏｈ ０１５７：Ｈ７的ｓｌｘＡ２基因， 试验结果显示，比较原位ＰＣＲ而言，温和的渗透性 及低等温条件使得原位ＬＡＭＰ引起较少的细胞损 伤。获得的图像分辨率更高。刘全英等ｎ０’将７份 ０１５７经１／１０—１／１０８倍递增稀释，与ＰＣＲ方法比较， 当稀释液至ｌ／１０５时ＰＣＲ方法就无法准确地检测， 而ＬＡＭＰ法当稀释倍数到ｌ／１０８时仍然能够获得较 好的扩增效果，且特异性高（１００％）。 ２．２志贺菌和侵袭性大肠杆菌检测 侵袭性大肠 杆菌由于生化反应不典型，血清学鉴定比较繁杂，且 部分血清型与志贺菌属间存在抗原交叉反应，不利 于侵袭性大肠杆菌的鉴定检测。２００５年Ｓｏｎｇ等“１通 过设计６对引物（包括４个特异引物和２个环引物） 来扩增志贺氏菌和侵袭性大肠埃希菌携带的侵袭性 质粒抗原基因（ｉｐａ Ｈ），用ＬＡＭＰ检测志贺氏菌和侵 袭性大肠埃希菌，实验在２ｈ以内完成，其最小检测 限达到８ｃｆｕ，而ＰＣＲ的检测限为８Ｘ １０２ ｃｆｕ。 ２．３沙门氏菌的检测 沙门氏菌是公认的食源性 疾病最常见的病原菌，２００３～２００５年食源性疾病监 测网的数据显示沙门氏菌占微生物食源性疾病的 １７．１９％，排在第２位１１２］。沙门菌血清型呈多样性， 生化鉴定繁琐复杂。２００５年Ｋａｙｏｋｏ Ｏｈｔｓｕｋａ等１１３对 疑被感染沙门氏菌的１１０个水样鸡蛋中进行抽样， 经过缓冲蛋白胨水中３７℃、２０ｈ的前增菌，检测结 果显示，ＰＣＲ漏检了１０％，ＬＡＭＰ及分离培养的检 出率为１００％，而ＬＡＭＰ比分离培养方法更快速、灵 敏和特异。朱胜梅等【１４摸索了ＬＡＭＰ检测沙门氏菌 的最佳检测反应条件，使沙门氏菌的ＤＮＡ检测灵
６１
要的食源性致病菌，感染导致肠炎疾病，发病率呈逐 年上升趋势。副溶血性弧菌致病因子是其携带的ｔｄｈ 和ｔｄｌ编码毒力基因，采用常规检测方法无法解决风 险监测和评估。徐芊等“７首次报道了利用ＬＡＭＰ技 术检测副溶血性弧菌，针对副溶血性弧菌不耐热溶 血素基因（ｔｌＩＩ）设计４条特异引物进行ＬＡＭＰ扩增， 对扩增反应进行优化，最佳反应时间为６０ｍｉｎ，反应 温度为６０℃，特异性为１００％，且副溶血性弧菌基因 组ＤＮＡ和纯培养物的检测灵敏度分别为９０ｆｇ和 ２４ｃｆｕ／ｍＬ，对模拟样品检测，检测限为８９ｃｆｕ／ｇ，整个 过程ｌ小时能完成检测。 ２．５阪崎肠杆菌检测２００２年国际食品微生物标 准化委员会（ＩＣＭＳＦ）把阪崎肠杆菌列为“严重危害 特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影 响”致病菌［１８１，该菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌 血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经 系统后遗症，死亡率２０％一５０％Ｉｔ９ Ｊｏ贺楠等∞参照 阪崎肠杆菌标准株（ＡＴＣＣ５１３２９）１６ＳｒＲＮＡ基因设计 ４条特异性引物。方法最低检测限可达到 ０．３ｐｇＤＮＡ，当稀释度１０５时才检测不到扩增产物，而 ＰＣＲ方法稀释度１０２时就检测不到扩增物。而胡莲 霞ｍ１则以１６Ｓ。２３Ｓ ｒＲＮＡ间区序列作为靶序列，采 用带有２条环引物（ＬＦ和ＬＢ）的改良ＬＡＭＰ方法检 测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，灵敏度为 ０．１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉 的检出限为１．１ｅｆｕ／ｇ，而对照ＰＣＲ方法检测阪崎肠 杆菌的灵敏度为１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的 婴儿配方奶粉的检出限为１ １００ ｃｆｕ／ｇ，改良ＬＡＭＰ 方法比较ＰＣＲ方法，其灵敏度提高了ｌ ０００倍，检测 耗时仅为ｌ～３ｈ。 ２．６金黄色葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌是一 种常见的致病菌，导致感染性疾病是其产生的肠毒 素造成的，且耐药性金黄色葡萄球越来越广泛。申 建维等勉荆用多重ＬＡＭＰ法同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ，在反应过程中，两种分子 信标荧光探针分别与ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ基因的扩增产物 序列互补结合，最后检测反应管中的两种荧光值。 结果显示该方法的检测下限为１０ｃｆｕ／ｍＬ，与传统的 Ｍ２Ｈ培养基苯唑西林药敏实验结果比较，灵敏度为 ９９．９％，特异度为９０．９％。适用于直接快速检测临 床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 ２．７单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李 斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致 病菌，ＷＨＯ已将其列为２０世纪９０年代食品中四大
万方数据
６２
致病菌之一。主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、 流产、无败血症性单核细胞增多症等，尤其是免疫力 低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病。在 单增李斯特氏菌中，ｈｌｖ基因编码的、能够结合胆固
Ｏ，呦）， 醇并被巯基活化的李氏溶血素（Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ
是单增李斯特氏菌最主要的致病因子，也是致病性 李斯特氏菌普遍存在的毒力基因，是其毒力标志基 因，在李斯特菌中是保守且特有的。袁耀武等∞Ｉ以单 核细胞增生性李斯特氏菌的李氏溶血素基因（Ｈｌｙ）为 靶基因，针对其中的Ｍ２４１９９基因设计４条ＬＡＭＰ反 应的引物，并采用ＦＴＡ滤膜技术提取模板ＤＮＡ，通过 优化的ＬＡＭＰ反应条件，成功地建立了检测单增李斯 特菌的ＬＡＭＰ方法。其敏感性检测限为７．３×１０ｌｃｍ／ ｍＬ，特异性检出限为８．９ Ｘ １０＇ｃｆｕ／ｇ。 ２．８蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌是最常见的食源 性病原菌，主要污染蛋白质和碳水化合物含量丰富 的食品（如奶制品、肉类、米饭、鱼、烧鸡等），属条件 致病菌，其症状表现为腹泻和呕吐，传统方法检验需 时４天。齐哲等圳利用蜡样芽孢杆菌溶血素基因的 ｈｂｌＡ基因的保守序列设计ＬＡＭＰ反应的引物，采用 ＦＴＡ滤膜提取ＤＮＡ，检测蜡样芽孢杆菌和人工污染 蜡样芽孢杆菌的消毒乳。ＬＡＭＰ方法的检出限为４．４ ｅｆｕ／ｍＬ，特异性为１００％，与普通ＰＣＲ方法相比，灵敏 度提高了ｌＯ倍，人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的 检出限为５７ ｃｆｕ／ｍＬ。ＬＡＭＰ扩增可在２０ ｍｉｎ内完成， 对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测可在２Ｉｌ内完成。 ２．９产肠毒素性大肠埃希氏菌产肠毒索性大肠埃 希氏菌（Ｅ１ＥＣ）是食源性重要的致腹泻致病菌，产肠 毒素性大肠埃希氏菌的耐热肠毒素（ｓＴ）及不耐热肠 毒素（ＬＴ）是其引发腹泻的主要毒素。占利等｛２５１参考 肠毒素性大肠埃希氏菌标准菌株ＣＭＣＣ４４８１４的ＬＴ Ｉ 毒素基因，设计了６条反应引物（ＬＴＩ—Ｆ３、ＬＴＩ—Ｂ３、 ＬＴ Ｉ—ＦＩＰ、ＬＴ Ｉ—ＢＩＰ、ＬＴ Ｉ—ＬＦ、ＬＴ Ｉ—ＬＢ），其ＬＡＭＰ 检测的特异性为１００％，灵敏度为１．０９×１０２ｃｆｕ／ｍＬ， 比较普通ＰＣＲ法（１．０９×１０３ ｃｆｕ／ｍＬ）高出１０倍。检测 时间仅需ｌｈ。 ２．１０香港海欧菌香港海鸥菌首次于２００１年在香 港一患者血液中分离出，是一种新发现的食源性致 病菌，可引起细菌性急性腹泻，受到广泛关注。２００７ 年美国学者Ｍａｒｃｏｓ等嘶１将香港海鸥菌与产肠毒素脆 弱类杆菌、产酸克雷伯杆菌同列入２００４～２００７年间 新发现的３种引起人类急性细菌性腹泻的病原体。 目前国内没有香港海鸥菌的检测标准方法。朱敏等
１环介导等温核酸扩增技术（“蚺口）
１．１ ＬＡＭＰ技术的原理该技术针对靶基因设计４ 条特别引物，利用一种链置换ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）在恒温条件（６５℃左右）保温约６嘶ｌｉｎ，即 可完成核酸扩增反应，扩增出ＬＡＭＰ特征性梯状条 带；通过增加设计两条环引物还可使反应速度提升