USCDC-肺炎链球菌

CHAPTER 8

Identification and Characterization of Streptococcus pneumoniae

肺炎链球菌是一种可以在细胞内或细胞外寄生革兰氏阳性球菌，以单个或短链的形式存在。该菌的生长条件较为严格，最适宜生长条件为35-37℃、5%CO2。通常可以在血平板（BAP）或巧克力平板（CAP）上生长。在血平板上菌落形态较小、灰色、湿润有时候有粘液，有α溶血现象（图1）。这种溶血特性可以将该菌与很多细菌区分开，但是无法与草绿色链球菌区别。但是该菌在培养24-28小时后，菌落形态表现为平坦、中心凹陷，而草绿色链球球菌不会出现以上变化（图2）。利用显微镜对菌落形态的观察有利于鉴别两种菌。在鉴定之前一定要分纯培养。在下列的鉴定程序中，应着重鉴别有肺炎链球菌的α溶血特性，35-37℃、5%CO2条件下培养时间<24小时经典肺炎链球菌菌落均会出现这种溶血特性。

下面的试验用于在BAP平板上鉴定肺炎双球菌相及相似菌落（图3）。肺炎链球菌可以通过同时进行革兰氏染色，触酶试验，奥普托欣敏感性试验进行鉴定，用胆盐溶解试验进行确证试验。如果这些试验鉴定是肺炎链球菌时，则进行血清分型。辅助用于鉴定肺炎链球菌分子分型方法将在第10章：PCR技术和第12章：分子技术中分别进行介绍。其他的方法见网址/ncidod/biotech/strep/strep-doc/index.htm.

由于此种细菌对于相关操作人员及环境存在潜在的危险，生物安全2级试验室是进行肺炎链球菌相关操作的必要条件。根据第4章的具体要求要求进行防护和操作。

图1.在血琼脂平板上，肺炎链球菌周围出现草绿色的α溶血环（黑色箭头所指）

图2.在血琼脂平板上，肺炎链球菌生长24-28小时后，菌落扁平、中央凹陷；而草绿色链球菌菌落中央仍然保持凸起

翻译人：limachao@

Figure 3.肺炎链球菌鉴别流程图

I.触酶试验

触酶能够将H2O2分解为H2O和O2。O2在液体中形成气泡。触酶试验最初用于革兰氏阳性球菌间的鉴别。葡萄球菌属触酶试验阳性，而链球菌属和肠球菌属都是触酶试验阴性。

A.触酶试验操作

1.挑取菌落在BAP平板上35-37℃5% CO2环境下，培养18-24小时。

2.在过夜生长的BAP平板上用无菌环挑取1个菌落涂抹在玻璃平板上。

不要将BAP的培养基成分挑取到玻璃板，因为培养基中的红细胞成分可以造成假阳性反应。

3.吸取1ml3% H2O2 溶液滴加于玻璃板上与细菌充分混合

也可以购买商品化的双氧水。

双氧水一旦打开，应保存于4℃，拧紧瓶盖。

4.观察细菌悬液是否立即产生气泡。

5.试验应作阳性对照和阴性对照。已知的葡萄球菌作阳性对照，其他的如链球

菌可作阴性对照。

B.触酶试验结果判读

如果没有气泡产生，则为阴性

如果有气泡产生则为阳性（图4）。

C.可能遇到的问题

假阳性的结果可能是在挑取菌落的时候，将平板上的红细胞带到菌落中。D.质量控制

试验中必须使用明确的触酶阳性、触酶阴性菌株作为质量控制。已经开启的触酶试剂每隔6个月需要用触酶阳性菌株验证有效性。

图4.触酶阴性和触酶阳性结果。阴性结果在滴加触酶试剂后未出现气。所有的链球菌属菌落触酶试验均为阴性。

II.奥普托欣敏感性试验

肺炎链球菌对奥普托欣敏感。奥普托欣敏感性试验可能会将部分α溶血性链球菌误鉴定为肺炎链球菌，尽管一小部分肺炎链球菌对奥普托欣耐受。非肺炎链球菌的α溶血性链球菌对奥普托欣耐受。

A.奥普托欣敏感性试验操作

奥普托欣纸片（P，6mm，5µg）一般采用商品化的成品。奥普托欣纸片常被称为“P纸片”，标记为“P”。

1.细菌培养BAP平板上35-37°C，5% CO2条件下培养18-24小时

2.用无菌取菌环挑取过夜培养的菌落接种于BAP上，划线涂布半个板。

一个平板上可以划线接种2个待检样品，但不要互相污染。

3.将奥普托欣药敏片贴于划线涂布处，35-37°C、5% CO2过夜培养

4.观察细菌生长情况，和抑菌环的大小。

B.结果判读

对于6mm5µg的药敏片，抑菌环等于14mm或者大于14mm为敏感，鉴定为肺炎球菌（图5）

测量抑菌环时应拿掉平板上盖，从平板上部测量

用尺子或者卡尺进行测量抑菌环。如遇到待测细菌完全对奥普托欣耐受，测量结果记录为纸片的直径。

C.可能遇到的问题

如果抑菌环小于14mm或者没有抑菌环，需要做胆盐溶解试验。因为肺炎球菌有时候是对奥普托欣耐受的。

D.质量控制

新购置的奥普托欣应当用阳性菌和阴性菌进行测试，保证纸片的有效性。肺炎链球菌ATCC 49619作阳性菌，缓氏链球菌ATCC 49456作阴性菌。

图5.肺炎链球菌的奥普托欣敏感性检测. 左侧的缓氏链球菌对奥普托欣耐受，未出现抑菌环。右侧的肺炎链球菌对奥普托欣敏感。

III.胆盐溶解试验

该试验能够区分肺炎链球菌和其他α溶血性链球菌。肺炎链球菌在胆盐中溶解其他的不行。2%脱氧胆酸钠溶液能够溶解肺炎链球菌的细胞壁。

A.配置2%的脱氧胆酸钠

1.将2克脱氧胆酸钠溶解于100毫升无菌蒸馏水中。

B.胆汁溶解试验操作

1.接种细菌BAP平板上，35-37°C，5% CO2培养18-24小时

2.将过夜培养细菌悬浮于1ml0.85生%生理盐水中达到0.5-1.0的麦氏单位。

3.将该细菌悬液等分成2管，每管0.5ml。

4.在其中一管中加入0.5ml 2%的胆盐，另一管中加入0.5ml的生理盐水，混合均

匀。

5.在35-37°C、5%CO2环境中培养

6.震荡混均试管。

7.10分钟后观察试管的浑浊度。如果10分钟后未溶解，需在35-37°C、5%CO2

培养2小时之后观察浑浊度。

C.胆汁溶解试验结果判读

添加胆盐溶液的试管浑浊度变清晰，而添加生理盐水对照管依然保持浑浊，显示试验结果为阳性（图6）。

D.可能遇到的问题

如果胆盐试验部分溶解的菌株肺炎链球菌鉴定试验不能判定为阳性。

胆汁溶解试验呈现部分溶解，且奥普托欣抑菌环小于14mm的菌株不能鉴定为肺炎球菌。

E.质量控制

试验应作阳性对照和阴性对照。肺炎链球菌ATCC 49619作阳性菌，缓氏链球菌ATCC 49456作阴性菌。

图6. 2株不同菌株的胆汁溶解试验结果。菌株1, 可以观察到添加胆盐溶液的试管浑浊度略微降低(左侧数第2支管), 但和对照相比浑浊度相似（最左侧管）; 因此菌株1不是肺炎链球菌菌。菌株2, 添加胆盐溶液的试管明显变澄清(最右侧管)，显示与对照管（右侧数第2支管）相比细菌已完全溶解，因此菌株2为肺炎链球菌。

IV.商品化的鉴定试剂盒

已经存在多个商品化的鉴定系统采用凝集法可用来鉴定肺炎链球菌的培养物。这类鉴定试验主要以标记有抗肺炎链球菌荚膜抗原的特异性兔源抗体的胶乳颗粒为基础。当肺炎链球菌荚膜抗原与标记有特异抗体的胶乳颗粒凝集时，肉眼可观察到相应的结果。当采用类似试剂盒时，必须严格按照生产厂家的说明进行操作。