新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版
天水地区新生儿先天性甲低现况调查研究
天水地区新生儿先天性甲低现况调查研究摘要】目的为了了解天水地区新生儿先天性甲状腺功能低下症的发病情况。
方法采用时间分辨荧光免疫分析法，测定新生儿出生72 h后足跟血的干血滤纸片中的促甲状腺激素(TSH)浓度，仪器和试剂均由芬兰PE公司提供，样本按照《新生儿疾病筛查技术规范》采集和递送。
结果共筛查本地区新生儿88081例，确诊甲状腺功能低下31例。
结论本地区新生儿先天性甲状腺功能低下症发病率为1:2841，为该类疾病的防治提供了科学依据。
【关键词】新生儿疾病筛查先天性甲低促甲状腺激素先天性甲状腺功能减退（CH），是新生儿先天性疾患的一种多发病，也是儿童时期常见的致残性疾病。
由于先天性甲状腺发育障碍或甲状腺素合成障碍导致甲状腺素分泌减少,使患儿神经系统发育障碍、生长发育迟滞、智能落后、严重者可致聋、哑、呆傻、瘫痪、丧失劳动能力。
先天性甲低治疗时间越早预后越好，大多数早期治疗病例均可获得较高智商，学习成绩满意。
新生儿促甲状腺素（TSH）浓度升高是先天性甲状腺功能低下症的最早实验室指标。
由于它的高度特异性和敏感性，检测分析新生儿促甲状腺素（TSH）浓度成为筛查诊断新生儿先天性甲状腺功能低下的第一选择，目前已把新生儿甲状腺功能低下症筛查作为优生优育、儿童保健、提高人口素质、防止CH该类疾病发生的重要措施之一。
1 对象与方法1.1筛查对象 2009年9月-2012年2月在天水地区新生儿疾病筛查中网络医院出生的新生儿88081例。
按《新生儿疾病筛查技术规范》采集和递送样本，标本采自出生72h充分哺乳6次以上的新生儿足跟血，滴于专用滤纸上，每例采集3个血斑，每个血斑直径＞8mm,采样滤纸于室温下自然晾干后置于密封塑料袋内，保存在2-8℃冰箱中，于5个工作日内由专人递送或邮寄到筛查中心。
1.2筛查方法 CH检测指标为新生儿样本干滤纸血片中的TSH浓度，试剂用进口芬兰PE公司生产的新生儿TSH荧光测定试剂盒，用现阶段最敏感时间分辨免疫荧光分析法按实验要求对新生儿样本干滤纸血片中的TSH浓度进行测定。
新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查实验影响因素
选择同一组T S H高值新生儿血样，按照不同的时间洗脱，其测定结果见表3。表中可见，洗脱时间过短可导致T S H测定结果降低，最佳洗脱时间以12小时为宜。
表3洗脱时间对干血片TSH测定结果的影响
讨论
1.保障新生儿筛查实验质量一直是世界关注的问题，据报道，目前尚没有一种十分完善的筛查方法可以使漏诊率降为0。在通过不断加强人员质量意识、责任意识教育，加强各筛查环节的质量控制克服漏诊的主观因素之后，选择灵敏度高、特异性强的筛查实验方法，克服影响实验结果准确性的各种因素对减少漏诊显得尤为重要。
新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查实验影响因素
摘要】目的探讨新生儿筛查滤纸干血样测定促甲状腺素（同时）的影响因素。方法用时间分辨荧光免疫法探讨多方面实验影响因素，观察其规律。结果新生儿筛查实验影响因素众多，TSH测定：72小时后采血结果稳定，季节间TSH水平有差异，建议使用不同筛查切值；滤纸血样自然干燥易于洗脱。结论某些因素影响筛查结果，选择最佳实验条件，能较好保证新生儿筛查实验质量。
【关键词】新生儿筛查滤纸干血样促甲状腺素
【中图分类号】R722.19【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）02-0219-02
目前，国内新生儿筛查广泛实施，主要以滤纸干血片采血法检测促甲状腺素（TSH）筛查新生儿中先天性甲状腺功能低下症。由于滤纸为其取样载体，加之被测物在血液中含量甚微，其检测结果容易受多种因素的影响。因此,系统探讨新生儿筛查实验的影响因素，减少或避免漏诊，是当前国内新生儿筛查蓬勃开展之际，极为必须的工作。对此对滤纸干血片采血法的诸实验影响因素进行了探讨，现报道如下。
材料和方法
1.血样收集：烟台市辖区内新生儿出生后72小时的血样2～4滴，要求血斑直径大于8 m m，浸透滤纸正反两面，于不同条件下干燥血样4479例，放专用塑料袋中4～10℃保存，集中送筛查中心实验室检测。
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
促甲状腺激素(TSH)测定试剂盒(化学发光免疫分析法)产品技术要求爱康试剂
促甲状腺激素（TSH）测定试剂盒（化学发光免疫分析法）1.性能指标1.1试剂条性能指标1.1.1外观试剂盒各组分应齐全、完整，液体无渗漏，包装标签应清晰、准确、牢固；试剂条中第7孔内组分应为棕色含固体微粒的液体或含棕色固体沉淀的透明液体；第12孔内化学发光底物应为无色或淡绿色液体；其余皆应为无色透明液体，无悬浮物、无沉淀、无絮状物。
1.1.2空白限应不大于0.005μIU/mL。
1.1.3准确度1.1.3.1在试剂盒规定的线性区间内，检测促甲状腺素国家标准品，测定结果的相对偏差应在±10%范围内。
1.1.3.2对具有溯源性的两个浓度水平的正确度控制品进行检测，检测结果与标定浓度的相对偏差应在±10%范围内。
1.1.4线性区间试剂盒在0.02μIU/mL~100μIU/mL区间内，其线性相关系数（r）应不小于0.9900。
1.1.5分析内精密度变异系数（CV）应不大于8.0%。
1.1.6批间精密度变异系数（CV）应不大于15.0%。
1.1.7特异性a)含浓度不低于200mIU/mL的FSH的零浓度TSH样本，检测结果应不高于0.005μIU/mL；b)含浓度不低于200mIU/mL的LH的零浓度TSH样本，检测结果应不高于0.005μIU/mL；c)含浓度不低于1000mIU/m L的HCG的零浓度TSH样本，检测结果应不高于0.005μIU/mL。
1.2校准品性能指标1.2.1外观校准品应为无色或浅黄色透明液体。
1.2.2装量装量偏差应在±10%之内。
1.2.3准确度Cal1、Cal2实测值与标示值的偏差应在±10%以内。
1.2.4均一性对同一瓶校准品1、校准品2分别重复10次检测，对同一批次10瓶校准品1、校准品2进行检测，检测校准品1、校准品2瓶内差CV应≤10%，批内瓶间差CV应≤10%。
1.3质控品性能指标1.3.1外观质控品应为无色或浅黄色透明液体。
石家庄市新生儿促甲状腺素筛查切值的探讨
石家庄市新生儿促甲状腺素筛查切值的探讨马翠霞;封纪珍;封露露;白雪;贾立云【摘要】目的分析石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心168 107例新生儿先天性甲状腺功能减低症(CH)的筛查数据,探讨建立石家庄市筛查CH切值的方法,避免漏诊和资源浪费,并指导后续的CH筛查工作.方法采用全自动时间分辨荧光检测仪(GSP-2021型)测定石家庄市168 107例新生儿足跟血干血斑的促甲状腺素(TSH)浓度,采用百分位数法和ROC曲线建立实验室TSH的筛查切值,并进行比较分析.结果 168 107例新生儿TSH浓度呈现偏态分布,确诊患儿80例,其中CH患儿62例,高TSH血症患儿18例,CH检出率为1/2 711.以99％的百分位数和经验确立筛查切值分别为8.2 μIU/ml和9.0 μIU/ml,分别导致3例患儿和8例患儿漏筛.采用ROC曲线得到的TSH切值为8.0 μIU/ml,此时约登指数最高,无漏筛情况.结论比较不同方法最终确定的TSH水平8.0 μIU/ml作为石家庄市新生儿疾病筛查促甲状腺激素的筛查切值.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2018(033)012【总页数】4页(P1061-1064)【关键词】新生儿筛查;甲状腺功能减低症;甲状腺激素类【作者】马翠霞;封纪珍;封露露;白雪;贾立云【作者单位】石家庄市妇幼保健院优生遗传科,河北石家庄050000;石家庄市妇幼保健院优生遗传科,河北石家庄050000;石家庄市妇幼保健院优生遗传科,河北石家庄050000;石家庄市妇幼保健院优生遗传科,河北石家庄050000;石家庄市妇幼保健院优生遗传科,河北石家庄050000【正文语种】中文【中图分类】R722.1先天性甲状腺功能减低症(CH)是儿科最常见的原发性内分泌疾病之一，它的致病机制较为复杂，主要是由于甲状腺的缺陷、不发育或发育不全以及甲状腺素合成途径缺陷等因素，导致新生儿体内促甲状腺素释放激素分泌不足，引起生长发育落后、智力、基础代谢率降低，从而进一步影响孩子的体格和智力发育[1]。
快速诊断试剂在新生儿促甲状腺素检测中的应用
ａｉ ｉ ｈ ｍ ｎ ｇｓ ｃ ｃｒ ｎｍ ｅｌ Ｊ ．Ｃ ｎｅ ｈｍ ｔｅ ｃｄ ｎ ｕ ａ ａｔ ａ ｉｏ ａｃｌ ｉ ｒ ｃ ｓ［ ］ ａｃｒＣ ｅ ｏｈｒ
Ａｐ ｌ ｉ ｇ ｏ ａ ｔｄ ａ ｎ ｓｓｒ ａ ｅ ｔｉ ｈ ｉ ｇ ｏ ｉ ｆｎ ｗｂｏ ｎｇ ＴＳ ｐ ｙ ｎ ｆｆ ｓ ｉｇ ｏ ｉ ｅ ｇ ｎ ｎ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｓｓｏ ｅ ｒ Ｈ
Ｙ ｅ Ｘ ４ ｅ－ ｅ，Ｗ ｏｇ— ｉ Ｗ ｔｔ ａ ｄＣ ｉ ｅｌ ａｅＨ ｓｉ ｌｆＺ ｕａ ｉ ， ｈ ｈ ｉ １０ １ Ｃ ｉ ） Ｕ ｆ ， Ｌ０ Ｇ ｆｉ Ｕ Ｈ ｎ ｑｕ（ ｏｕｎ ｒ ｈｌ Ｈ ａｔ Ｃ ｒ ｏ ｔ ｈ ｈ ｉ ｔ Ｚ ｕａ ９０ ， ｈｎ ｉ ｔ ｔ ｄ ｈ ｐａｏ Ｃｙ ５ ａ Ａ ｓｒｃ： ｊｃｉｅ Ｔ ｖｌａｉ ｅａａ ｓ ｅ ｏｍ ｎｅｏ ｅｆ ｔ ｉｇｏｉ ｒ ｇｎ ｉ ｔｅｄａｎｓ ｆ ｅ ｂｒ Ｔ Ｈ．Ｍｅｈ ｂ ｔ ｔ Ｏｂｅｔ ｏｅａ ｔ ｎｔ ｎｌ ｉ ｐｒ ｒ ａｃ ｆｈ ｓ ｄａｎｓ ａｅｔｎ ｈ ｉ ｏｉ ｏ ｗ ｏ ａ ｖ ｕ ｏ ｈ ｙｓ ｆ ｔ ａ ｓｅ ｇ ｓ ｎ ｎ Ｓ ｔ－
了诊 断 胃 恶 性肿 瘤 发 生 的检 测 指 标 。
强 的 主观 性 ， 此端 粒 酶 活 性 的 检 测 有 望 成 为 今 后 临 床 早 期 因 诊 断 胃息 肉癌 变 潜 能 和 趋 势 的 客 观 的 有 价值 的 观 测指 标 。
４ 参 考 文 献 ［ ］ Ｈ Ｋ， ｕｎＪ Ｈ ｌ ｉｒｎ ｒｓａｃ ｆｅ ｍ ｒ ｅ １ ｕＫ Ｙ ａ Ｄ， ｕＱ ｔ ｌｅｔｅｅｒｈｏ ｌ ｅａ ．Ｃ ｒ ｔｏ ｓ
新生儿疾病筛查技术操作程序
血片采集规范（一）血片采集人员清洗双手并佩戴无菌、无滑石粉的手套。
（二）按摩或热敷新生儿足跟，并用75%乙醇消毒皮肤。
（三）待乙醇完全挥发后，使用一次性采血针刺足跟内侧或外侧，深度小于3毫米，用干棉球拭去第1滴血，从第2滴血开始取样。
（四）将滤纸片接触血滴，切勿触及足跟皮肤，使血液自然渗透至滤纸背面，避免重复滴血，至少采集3个血斑。
（五）手持消毒干棉球轻压采血部位止血。
（六）将血片悬空平置，自然晾干呈深褐色。
避免阳光及紫外线照射、烘烤、挥发性化学物质等污染。
（七）及时将检查合格的滤纸干血片置于密封袋内，密闭保存在2～8℃冰箱中，有条件者可0℃以下保存。
（八）所有血片应当按照血源性传染病标本对待，对特殊传染病标本，如艾滋病等应当作标识并单独包装。
苯丙氨酸浓度检测操作程序：1、普通荧光法新生儿苯丙氨酸试剂盒置室温半小时。
2、配制PKU试剂，于实验前一天将6.5mLPKU配制缓冲液加入一瓶PKU试剂中，用力振荡30~60分钟使完全溶解，放置4℃冰箱备用。
3、配制萃取液，现用现配，3份硫锌酸加入2份无水乙醇振荡混匀。
4、用打孔器在载血滤纸上打下3mm直径的标准品、质控品和标本。
标准品、质控品为双孔，标本为单孔。
依登记次序放入U型微孔内。
5、向微孔中加入15μL萃取液，尽量加到血片上，放振荡器上慢振5分钟，使混匀。
6、室温静置30~60分钟或+2~+8℃放置18小时孵育。
7、每孔中加入40μL去离子水，轻轻震荡或用移液器吹吸三次，使混合均匀。
8、从每孔中吸出25μL到白色微孔板中，加水后1小时内完成该项操作，注意每次转移溶液后都要更换移液器吸头。
9、在每个微孔中加入50μL配制好的PKU试剂，注意移液器的吸头不要触及孔内溶液，应在第八步完成后1小时内进行完毕，轻轻震荡微孔板使溶液混合均匀。
将微孔板在+60℃恒温孵育箱中静置40分钟以上或在+37℃恒温孵育箱中静置120~140分钟。
10、平衡至室温后，在每个微孔中加入200μL铜试剂，轻轻震荡微孔板使混匀，室温孵育60~90分钟。
新生儿疾病筛查质量控制标准
附件 1：一、新生儿疾病筛查质量控制系统(一)组织网络及职责分工质量控制系统由省级新生儿疾病筛查质量控制中心、各市新生儿疾病筛查分中心、单项听力筛查机构及采血机构等组成。
省级新生儿疾病筛查质量控制中心提供新生儿疾病筛查技术服务，同时负责协助省卫生厅对全省新生儿疾病筛查工作进行业务管理、人员培训、技术指导和质量控制，定期向省卫生厅上报全省筛查工作情况和质控情况，并向各筛查机构反馈质控结果。
新生儿疾病筛查分中心提供筛查服务，负责培训和指导本区域相关筛查人员，做好筛查信息资料的采集、汇总、分析和上报，同时做好本单位和所辖区域的质控工作。
单项听力筛查机构提供听力筛查服务，做好筛查信息资料的采集、上报以及本单位筛查质控工作。
采血机构要做好新生儿疾病筛查的宣传、咨询和筛查血片的采集工作。
(二)工作要求及相关制度各新生儿疾病筛查机构应建立筛查质量控制小组，每月进行质控活动一次，对本筛查机构及所辖区域的筛查工作进行质量控制检查和监督管理，并做好总结，以保证和提高筛查工作的质量和水平。
各新生儿疾病筛查机构要制定新生儿疾病筛查相关部门的工作制度、转诊制度、跟踪追访制度、标本采集及管理制度、统计汇总及上报制度以及相关的操作规程。
二、新生儿听力筛查质量控制标准(一)基本要求机构设置、人员、房屋和设备符合卫生部《新生儿疾病筛查技术规》(卫妇社发[2004]439 号) (以下简称《新筛规》)的要求。
(二)筛查对象所有活产新生儿，特别是高危新生儿。
(三)新生儿听力筛查时间初步筛查(初筛) :新生儿生后3~5天。
第2次筛查(复筛) :婴儿出生42天。
初筛未通过、可疑或者初筛已经通过但属于重症监护病房患儿等听力损失高危儿,需要进行听力复筛。
(四)新生儿听力筛查环境、方法和步骤遵《新筛规》。
其中，听力筛查主要采用畸变产物耳声发射(DPOAE) 或者自动听性脑干诱发电位(AABR)。
(五)目标1个月进行筛查。
对初筛阳性者在出生42天进行复筛， 3个月进行诊断， 6个月进行干预。
101028例新生儿促甲状腺素筛查结果分析
【 关键词 】 新生儿 ； 甲状腺 素； 促 先天性 甲状腺功能减退症
Ａｎ ｌ ｓ ｓ ｏ ０１ ０ ８ ｃ ｓ ｓ ｏ ｅ ｎ ｔ ｌＴＳ ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｒ ｓ ｌ ｓ ａ ｙ ｉ ｆ１ ， ２ ａ ｅ ｆｎ ｏ ａ ａ Ｈ ｃ ｅ ｎ ｎ ｅ ｕ ｔ
促甲状腺激素测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)产品技术要求广州市丰华生物
2. 性能指标2.1 装量试剂盒各溶液最大允许负偏差为 6.0％。
2.2 外观试剂盒中校准品为无色或者淡黄色液体，其它液体组份试剂均为澄清透明；微孔反应板应封口良好，无破损。
2.3 灵敏度试剂盒的灵敏度应不高于0.25μIU/ml。
2.4 特异性用黄体生成素（hLH）250U/L 进行检测，测得表观hTSH 浓度不高于0.25μIU/ml。
用促卵泡激素（hFSH）250U/L 进行检测，测得表观hTSH 浓度不高于0.25μIU/ml。
用绒毛膜促性腺激素（hCG）10000U/L 进行检测，测得表观hTSH 浓度不高于0.25 μIU/ml。
2.5 线性相关系数试剂（盒）的线性范围（0.25 μIU/ml～324 μIU/ml）内的线性应符合如下要求：a)线性相关系数r≥0.990；b)检测浓度＜100μIU/ml 的hTSH 时，线性的绝对偏差应在±10μIU/ml 范围内；检测浓度≥100μIU/ml 的hTSH 时，线性相对偏差不超过±20%。
2.6 测量准确度测定浓度为50μIU/ml（允许偏差为±20%）的hTSH 国家标准品，测定结果的相对偏差应在±10%范围内。
2.7 测量精密度2.7.1 批内不精密度试剂盒的批内不精密度（CV）应不超过15.0%；2.7.2 批间不精密度试剂盒的批间不精密度（CV）应不超过20.0%。
2.8 质控品测定值用三种不同浓度的质控品进行测定，测定结果应在允许范围内。
2.9 HOOK 效应检测浓度为2000μIU/ml 的hTSH 时，其荧光值仍高于324μIU/ml 校准品的荧光值。
《新生儿疾病筛查技术要求规范》(2010年版)
新生儿疾病筛查技术规范（2010年版）卫生部二〇一〇年十一月目录新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范 (1)新生儿遗传代谢病筛查实验室检测技术规范 (5)苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症诊治技术规范 (10)新生儿遗传代谢病筛查操作流程 (16)新生儿遗传代谢病筛查知情同意书 (17)新生儿听力筛查技术规范 (18)新生儿听力筛查技术流程 (26)新生儿听力筛查知情同意书 (27)新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范血片采集是新生儿遗传代谢病筛查技术流程中最重要的环节。
血片质量直接影响实验室检测结果，开展新生儿遗传代谢病血片采集及送检的医疗机构应当按本技术规范要求完成血片采集工作。
一、基本要求（一）采血机构设置。
设有产科或儿科诊疗科目的医疗机构均应当开展新生儿遗传代谢病筛查血片采集。
（二）采血人员要求。
1.具有与医学相关的中专以上学历，从事医学临床工作2年以上。
2.接受过新生儿遗传代谢病筛查相关知识和技能的培训并取得技术合格证书。
培训内容包括：新生儿遗传代谢病筛查的目的、原则、方法及网络运行；滤纸干血片采集、保存、递送的相关知识；新生儿遗传代谢病筛查相关信息和档案管理。
二、采血机构和人员职责（一）积极开展新生儿遗传代谢病筛查的宣传教育工作。
（二）加强对本机构血片采集人员的管理和培训。
（三）承担本机构新生儿遗传代谢病筛查有关信息的收集、统计、分析和上报工作。
（四）血片采集人员在实施血片采集前，应当将新生儿遗传代谢病筛查的目的、意义、筛查疾病病种、条件、方式、灵敏度和费用等情况如实告知新生儿的监护人，并取得书面同意。
（五）认真填写采血卡片，做到字迹清楚、登记完整。
卡片内容包括：采血单位、母亲姓名、住院号、居住地址、联系电话、新生儿性别、孕周、出生体重、出生日期、采血日期和采血者等。
（六）严格按照新生儿遗传代谢病筛查血片采集步骤采集足跟血，制成滤纸干血片，并在规定时间内递送至新生儿遗传代谢病筛查实验室检验。
时间分辨荧光免疫法在新生儿先天性甲状腺功能减退中的检测分析
进行提高 ，或许 能够提高相应检出率 。 综上所述 ，，Ｉ’Ｒ兀Ａ法作为新 生儿先天性 甲状腺 功能减退的
筛查方法是可靠 的 ，具有检测质量稳定、敏感度高 的特点 ，值
得在临床上加以推广 和应用 。
参 考 文 献
１ 王志国，李小鹏 ，武平原 ．２００１年全 国新 生儿疾 病筛查 实验室 质
【关键词 ｌ 婴儿，新 生；时光分辨 荧光免疫法；先天性 甲状腺功能减退症 【中图分类号】Ｒ ５８１．２ 【文献标识码】Ｂ 【文章编号】１６７４—３２９６ （２０１３）０２—０１０６—０１
新生儿疾病筛查工作一直是临 床检验工作 中的一个 重点 ， 指对患儿在临床上并未有明显症状 ，但体 内的生化 、激素水平 已经 出现改变 的这 种情况做 出筛查 ，通 过检 验为临床 提供依 据 ，做出早期诊断 ，更好、更及 时地对此类疾病做 出治疗 ，防 止疾病进一 步发展 对 患儿 的重要 器 官造 成更 严重 的伤 害… 。 为了提高筛查质量 ，为临床提供更准确的诊断依 据，本研究近 年来采用时光分辨荧光免疫法 （ＴＲＦＩＡ）对新生儿的先天性 甲 状腺功能减退 （ＣＨ）进行 了筛查 ，现报道如下 。 １ 资 料 与方 法 １．１ 临床资料 选取我院２００８年 １月—２０１２年 １月所收治的 １２４６２名足月 出生 、无畸形 的正常新生儿 的临床资料。 １．２ 血 片 采 集 在新 生 儿 出生 ７２ｈ之后 且 至 少 吃奶 ６次 以上 ， 方可进行足跟末梢采血 ２滴作为实验标本 ，让血滴 自然流出之 后采用 Ｓ＆Ｓ ９０３专用滤纸片进行采集 ，待血液渗透滤纸形成两 个 血斑之后将其放置于室温下 自然干燥 ，对每个标本进行单独 放置并详细填写姓名、性别 、地址等信息 ，之后冷藏于 ４℃冰 箱内保存 ，作为筛查之用 。 １．３ 试验方法及仪器 将 以上 新生儿 血液标本 分别采用 ＴＲ－ ＦＩＡ法和酶联免疫 吸附试 验 （ＥＬＩＳＡ）法进行筛查 。，Ｉ＇ＲＦＩＡ法 中时光分辨荧光免疫检测仪 采用芬兰产 Ｗａｌｌａｃ １４２０型、试剂 盒为配套 Ｎｅｏ—ｈＴｓｈ试剂 盒 ；ＥＬＩＳＡ法 的酶 标仪 采用美 国产 Ｂ１０一ＲＡＤｍｏｄｅｌ ５５０型进行 筛查 ，样 品测定 中均带有 内质 控 ， 包括质控结果在 内的所有操作严格按 照说 明书进行。 １．４ 结果判定 ＥＨＳＡ的筛查 切值为 ２０￣ｇ／ｍｌ。ＴＲＦＩＡ的判 断标准为 （￣Ｕ／ｍｌ ｂｌｏｏｄ）： ＜９为阴性 ；９—１８为可疑 ； ＞１８ 为 ＣＨ。筛查值均用原标本进行 复查 ，确保实验结果 不出现偏 差 ，复查结果仍在切值 以上者视为初检阳性 ，随即采用放射免 疫法 （ＲＩＡ）进行对照 检测 ，检 测血清 中 Ｌ、Ｔ４以及 ＴＳＨ水 平 ，ＴｓＨ≥２０ｍＵ／Ｌ且 Ｔ４＜４８ｒ ｉｇ／ｍｌ视 为 ｃＨ；ＴＳＨ≥２０ｍＵ／Ｌ 但 Ｔ４水平正常则视为非典型 甲状腺功能减退 。 １．５ 统计 学方法 采用 ＳＰＳＳ１５．０统计软件进 行统计学处 理 ，
促甲状腺素(TSH)试剂盒批间差异对实验结果的影响及纠正措施
doi：10.3969/j.issn.1009-4393.2020.20.052--临床研究--促甲状腺素（TSH）试剂盒批间差异对实验结果的影响及纠正措施张虹1，2，张国文1，朱伟2，袁帅2（1.宿迁市妇幼保健院新生儿疾病筛查实验室，江苏宿迁223800；2.宿迁市妇产医院新生儿疾病筛查实验室，江苏宿迁223800）摘要：目的分析试剂盒批间差异对实验结果的影响，重点排查是否会造成漏筛。
方法采用第三方质控品比较27573例样本在使用两个不同批号试剂间的差异。
结果批号658663试剂检测初筛样本数19090例，中位数为1.40，95%和99%百分位数分别为5.62和9.30，低、高值质控浓度均值分别为9.176、36.679，标准差（SD）分别为0.728、2.800，变异系数（CV）分别为7.93%、7.63%；确诊先天性甲状腺功能减退症（CH）9例，高TSH血症5例，CH发病率为1/2121。
批号661537试剂共检测的初筛样本数为8483例，中位数为1.41，95%和99%百分位数分别为4.90和7.65，低、高值质控浓度均值分别为8.78、34.81，标准差分别为0.69、1.93，变异系数分别为7.83%、5.54%，确诊CH4例，高TSH血症1例，另有1例失访，CH发病率为1/2121。
结论促甲状腺素（TSH）试剂盒658663试剂和661537试剂两批号间存在显著性差异，降低661537试剂切值，可防止漏筛。
关键词：促甲状腺素；第三方质控品；切值促甲状腺素是腺垂体分泌的重要激素，参与甲状腺细胞的发育、合成及甲状腺激素的分泌。
一方面，该激素水平受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素（TRH）的促进性影响，另一方面又受到甲状腺激素反馈性的抑制性影响，二者互相拮抗，在多种甲状腺疾病筛查中具有重要价值。
促甲状腺素作为实验室常用检测指标，要获得准确的测定结果，需建立全面的质量控制体系，包括室内质量控制和室间质量评价，并根据实验室情况不断改进[1-3]。
沈阳地区新生儿先天性甲低筛查促甲状腺素切值研究
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新生儿疾病筛查检验技术
新生儿疾病筛查检验技术新生儿疾病筛查技术是指用于检测新生儿某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病的先进实验室检测技术。
从而早期诊断、早期治疗。
根据我国《母婴保健法》要求至少开展先天性甲低（CH）和苯丙酮尿症（PKU）两项筛查。
CH和PKU患儿在出生后往往缺乏疾病的特异表现，一般要到月龄6个月才逐渐出现固有的临床症状，并日趋加重。
然而，一旦出现了疾病的临床症状，表明疾病已进入了晚期。
即使治疗，智力低下等也难以恢复；相反，若能在出生不久即发现疾病，及时治疗，极大多数患儿能正常发育，其智力亦可达到正常人的水平。
筛查试验结果是早期发现阳性患儿的唯一指征，因此筛查实验室的管理和规范是整个筛查环节的重中之重。
一、苯丙氨酸测定（一）检验方法学以苯丙氨酸（Phe）作为新生儿疾病苯丙酮尿症的筛查指标。
筛查方法主要有荧光分析法、定量酶法、细菌抑制法和串联质谱法。
1.荧光分析法（1）原理：从干滤纸血片上提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。
在激发光波长390nm，发射波长485nm处测定荧光强度。
苯丙氨酸含量与荧光强度成正比，通过检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘制曲线，可求得各样本的苯丙氨酸浓度。
试验中加入二肽L亮氨酰-L丙氨酸后可大大增强此荧光反应，用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件pH在5.8±0.1，保证理想的荧光值和最大的特异性。
加入铜试剂进一步增强反应并降低背景。
（2）器材：荧光读数仪、60℃恒温孵育箱、孵育/振荡仪、3.2mm打孔器或打孔钳、加样器、八道加样器。
（3）试剂：苯丙氨酸标准品（phenylalanine calibrtors）、苯丙氨酸质控品（phenylalanine controls）、硫酸锌试剂（zinc sulfate reagent）、PKU试剂即茚三酮（PKU reagent）、铜试剂（copper reagent）、PKU 复溶缓冲液（PKU Reconstitution buffer（内含琥珀酸钠缓冲液L 亮氨酰-L丙氨酸和防腐剂）、白色微孔板96孔（white microtiter plate）。
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新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版IBMT standardization office【IBMT5AB-IBMT08-IBMT2C-ZZT18】新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制 谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情（广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ）摘要：目的利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。
方法采用了一株TSH单克隆抗体用于固相包被，另一株TSH单克隆抗体用于标记铕（Eu3+），固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测Neonatal TSH。
结果自建的Neonatal hTSH TrFIA法灵敏度高可达2.28μU/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。
与hLH、hFSH、HCG无明显交叉反应。
分析内或分析间质控结果在靶值±25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数(CV)分别为7.12%和6.09%，7.82%和7.03%。
与DELFIA ? Neonatal TSH试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为1.05。
与DELFIA ? Neonatal TSH试剂比对试验符合率一致，相关性系数r可达0.9822。
试剂盒室间质评能力比对成绩100%。
结论自建的Neonatal TSH TrFIA法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。
?基金项目：科技型中小企业技术创新基金（08C26114411281），广州市科技计划项目（2006V42C0051）。
作者简介：谭玉华，1980年10月，男，医学学士，检验技师，主要从事标记免疫试剂的研发、应用和医学检验工作。
Email:tanywhy@关键词：新生儿；促甲状腺素；时间分辨荧光免疫分析Time-resolved Fluoroimmunoassay of Neonatal Hypothyropin and Preparation ofIt’s Test ReagentTan Yu-hua,Feng Jian-ming, Lu Shun-duo, Luo Jian-an, Li Jian-guo, Ji Tao,LiGui-qing( Guang zhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 China) Abstract:Objective To establish a method of Time-resolvedFluoroimmunoassay(TrFIA) for the quantitative determination of human thyroid stimulating hormone(hTSH) in blood specimens dired on filter paper as an aidin screening newborns for neonatal hypothyroidism,and to prepare it’s test reagent .Methods The method based on solidphase sandwich TrFIA for Neonatal Hypothyropin(Neo-hTSH),which used two anti-TSH monoclonal antibody -one was coated on microplates and another was labeled by Europium. Results The assay sensitivity of the method was 2.28μU/ml.The correlation coefficient of self made kit’s curve was 0.9987.There was no obvious cross-reaction to human luteinizing hormone(hLH) , human follicle stimulating(hFSH) and humanchorionic gonadotropin(HCG).The intra-assay and the inter-assay measuredvalues of controls were not more than 25% difference from their labeled values, still their intra-assay and the inter-assay coefficients of variation(CV) of low and high controls were 7.12% and 6.09%, 7.82% and 7.03%,respectively. The correlation coefficient of self made Kit and DELFIA ? Neonatal TSH kit was0.9822,and the results of self made Kit and DELFIA ? Neonatal TSH kit were showing no difference. The lab’s proficiency testing was excellent. Conclusions The Neonatal TSH TrFIA established which has several advantages including high sensitivity, strong specificity, good accuracy, nice precision, and non-radioactive immunoassay. It is suitable for clinical use.Key words: Neonatal; Hypothyropin; Time-resolved Fluoroimmunoassay 新生儿血液中促甲状腺素（Neonatal TSH）浓度升高(出生72小时后采血)是原发性甲状腺功能低下症（CH）最早的实验指标。
CH是造成儿童智力低下和生长发育迟缓的重要疾病之一。
通过新生儿筛查，可及早诊断和阻断疾病发展，预防脑损伤的发生。
国内由于筛查技术的滞后，新生儿疾病的筛查尚待普及。
国内外资料表明开展和推广新生儿疾病的筛查，其经济意义和社会意义日益显着。
随着《中华人民共和国母婴保健法》的颁布，对依法进行新生儿疾病筛查提供了有效的法律和政策支持。
并且TrFIA法为卫生部新生儿疾病筛查质控中心推荐的首选方法[1]。
经过多年研究，我们建立了Neo-hTSH TrFIA法，并研制出了诊断试剂盒，现报道如下。
1 材料与方法1.1 标本标本均在受试者知情同意下通过S&S903滤纸收集，严格按要求操作[2-4]，由郑州大学第三附属医院、沈阳市妇幼保健所新筛中心、佛山市顺德区妇幼保健院提供。
1.2 材料与仪器分别用于包被和标记的两株鼠源性促甲状腺素单克隆抗体（进口分装），TSH纯品、牛血清白蛋白（BSA）和Tween80（Sigma公司）。
Sepharose CL-6B （Pharmacia公司）。
96孔微孔板（Thermo Labsystems公司）。
铕(Eu3+)标记试剂盒（Wallac公司）。
β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的Eu3+发光增强液[5]、洗涤液[6]和含有小牛血清(200ml/L)的50mmol/L pH7.80Tris-HCl溶液为分析缓冲液[6]均为自制。
其余试剂2D1420型为国产分析纯试剂。
冻干机（上海浦东冷冻干燥设备有限公司）。
VictorTMTrFIA检测仪及配套DELFIA ? Neonatal TSH试剂（Perkin Elmer公司）。
恒温振荡仪（广州丰华公司）。
1.3 标准血片、质控血片制备用TSH纯品按50-55%的血细胞比容由人全血制备，由本公司生产部提供。
1.4 固相抗体包被板的制备将包被抗体用50mmol/L pH4.6柠檬酸缓冲液稀释至3.00μg/ml，在96孔微孔板各孔中加200μl，4℃过夜，弃去包被液，洗涤1次，每孔加280μl含有10.0g/L BSA的10mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，37℃封闭2h，弃去封闭液，真空抽干过塑冷藏。
1.5 铕标记物的制备将1mg的标记抗体加入含有1mg的Eu3+冻干粉小瓶中，室温振荡反应48h。
反应液经用50mmol/L pH7.80Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm 监测收集第一洗脱峰。
×40cm）层析，A2801.6 建立Neo-hTSH TrFIA检测方法采用双抗体夹心法，将标准品、质控品或样本用打孔器打下直径约3.2mm样品盘于固相抗体包被板中，再加入用分析缓冲液1：1200稀释的铕标记物 200μl室温振荡4h（室温法）或室温振荡15min后置于4℃过夜孵育再室温振荡1h（过夜法），洗涤6次，加入增强液200μl ，振荡5min后，于1420时间分辨仪上用随机配备的Workstation软件荧光计数和用Multicalc软件进行拟合分析。
1.7 Perkimelmer公司DELFIA ? Neonatal TSH检测方法严格按仪器和试剂说明书操作检测。
1.8 评价参数评价试剂盒的分析灵敏度、分析特异性、准确性、精密度，建立试剂盒的参考值，并与国外同类产品进行比对试验。
1.9 统计学处理 Neonatal TSH TrFIA标准曲线分析（有效剂量（ED）、变异系数（CV）等）及结果由Victor TM2D1420仪随机配备Multicalc软件自动给出。
其它平行对照实验均采用配对t检验分析或直线相关性分析。
测试值与靶值间采用偏倚分析。
2 结果2.1 上述包被抗体浓度、包被与封闭温度与时间[7]、反应温度与时间[7-8]、铕标记物工作浓度、洗板次数等均采用棋盘方阵滴配法确定。
2.2 方法学评价参数2.2.1 剂量反应曲线采用LIN-MEAS拟合模式，绘制标准曲线如图1。
在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。
图1 自制试剂盒剂量-反应曲线2.2.2 分析灵敏度以自制试剂1 μU/mL全血标准品重复检测20次，以x +2s的荧光值在曲线上得到相应浓度为检测低限，则本方法的检测低限可达2.28μU/ml。