细胞介导细胞毒作用检测法：LDH释放法

adcc ldh方法

adcc ldh方法
ADCC，全称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是一种生物学反应，涉及抗体与靶细胞表面的抗原特异性结合，然后通过NK细胞等具有杀伤细胞功能的细胞杀死靶细胞。

至于LDH（乳酸脱氢酶）释放法，它是高通量检测的一种方法。

当NK细胞杀死靶细胞后，靶细胞中的LDH会释放到培养基中，通过电子载体的作用，WST会发生颜色反应，WST甲臜产物的吸光度与LDH量呈正比，可以反映死亡和受损伤靶细胞的数量。

请注意，由于医学专业领域的复杂性，如需获取更多准确信息，建议咨询相关医学专家或查阅相关医学文献资料。

细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究

细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科，而药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。

这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。

本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。

1. 细胞存活率测定法细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。

该方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。

常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。

MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细胞存活率的。

MTT是一种黄色草酮类化合物，可以被活细胞内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活（如线粒体呼吸链复合物）还原为紫色的结晶物。

通过把MTT溶液添加到细胞培养板中，待细胞生长一段时间后，通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物，最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。

CCK-8（cell counting kit-8）法是一种类似于MTT法的细胞存活率测定方法。

CCK-8是MTT法的改进版，它具有更高的灵敏度和更好的线性关系。

该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物（如细胞色素c）来评估细胞存活率的。

LDH（lactate dehydrogenase）释放法是一种衡量细胞毒性的常用方法。

LDH是存在于细胞质中的酶，只有在细胞膜破裂释放到培养液中时才会被检测到。

通过测量培养液中的LDH含量，可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。

2. 细胞凋亡检测法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，与多种疾病的发生和药物治疗效果密切相关。

因此，在药物筛选与评价中，细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。

常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。

细胞毒性检测方法总结!

细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。

2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。

二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。

当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。

该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。

特点： 1）简单、快速。

2）板式检测，可进行高通量。

三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。

通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。

ldh释放量计算公式__概述说明以及解释

ldh释放量计算公式概述说明以及解释1. 引言1.1 概述引言部分是对全文进行概述和介绍的重要部分。

本文将讨论LDH释放量计算公式的定义、意义以及其在医学领域中的应用与解释。

LDH（乳酸脱氢酶）释放量计算公式是一种常用于评估细胞损伤程度的方法，通过测定LDH活性来推导细胞受损程度。

本文将深入探讨LDH释放量计算公式的原理、推导过程以及其在医学领域中的具体应用及局限性。

1.2 文章结构本文共包含五个部分：引言、LDH释放量计算公式、应用与解释、结论和参考文献。

接下来的内容将按照这个顺序进行阐述。

1.3 目的本文旨在详细介绍LDH释放量计算公式，包括其定义、意义、测定方法以及相关应用和解释。

通过阐述其原理和推导过程，读者可以更好地理解LDH 释放量计算公式在评估细胞损伤方面的作用，并了解该方法在医学领域中的应用前景，以促进未来的研究和发展。

2. LDH释放量计算公式2.1 LDH释放量的定义与意义LDH（乳酸脱氢酶）是一种存在于细胞质和线粒体内的酶，它在细胞能量代谢中起着重要的作用。

LDH释放量是衡量细胞损伤程度和组织疾病状态的指标之一。

当细胞受到损伤或发生疾病时，LDH会从细胞内释放到外部环境中，因此测定和计算LDH释放量对于评估疾病的严重性以及治疗效果具有重要意义。

2.2 LDH测定方法简介目前常用的LDH测定方法主要包括光度法、电化学法和免疫学法等。

其中，光度法是一种经典的测定方法，通过测定产生的NADH（还原型辅酶Ⅰ）数量来间接反映LDH活性水平。

而电化学法则利用电极检测样品中由LDH产生的还原电流强度来确定其活性。

免疫学法则使用特异性抗体与LDH结合并形成可检测信号进行定量分析。

2.3 LDH释放量计算公式的推导LDH释放量的计算公式可以根据上述测定方法获得的实验数据得出。

一般来说，LDH释放量的计算公式如下：LDH释放量（U/L）=（样品测定值-背景测定值）/体积×稀释倍数其中，样品测定值是指待测样品中LDH含量所对应的实验结果；背景测定值是无待测物的标准控制样品或空白试剂在相同条件下进行测定后所得到的实验结果；体积是指用于测定的样品体积；稀释倍数则表示了对待测样品进行稀释处理时所需的倍数。

NK细胞毒活性-LDH释放法

1只/组
2. YAC-1 1*105 * 2ml 3. 培养液（1640) 无FCS
5ml/ 组
3. 培养液(1640) 3%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液）1ml/组
·3·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 NK细胞的杀伤活性。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数（cpm)，即可计算出NK细胞活性。

LDH释放法检测肿瘤患者PBMC和CIK细胞的细胞毒活性

LDH释放法检测肿瘤患者PBM C和CIK细胞的细胞毒活性X张　蕾a,李芳秋a,张士新a,黄海嵘b,李德闵b(南京军区南京总医院a.解放军临床检验医学研究所;b.心胸外科,南京　210002)摘　要:目的　建立检测细胞毒活性的乳酸脱氢酶(L DH)测定法,了解肿瘤患者外周血单个核细胞(PBM C)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的抗肿瘤活性,为肿瘤的免疫细胞治疗提供参考。

方法　采集肿瘤患者和健康成人外周血,常规分离PBM C,体外进行CIK的培养,用L DH释放法分别检测PBM C和CIK对肿瘤细胞K562的细胞毒活性。

结果　肿瘤患者PBM C对K562的杀伤活力比正常人显著降低(P<0.05)。

经多种细胞因子诱导培养7～10d后,健康人和肿瘤患者的CIK 对K562的杀伤活力都有显著提高(P<0.01),肿瘤患者CIK杀伤活力接近于健康人。

结论　肿瘤患者P BM C细胞毒活性显著降低,但经诱导培养成CIK后则显著提高。

用L DH释放法检测肿瘤病人CIK细胞毒活力,有助于CI K疗法适应病人的选择及个体疗效观察。

关键词:乳酸脱氢酶释放法;细胞因子诱导的杀伤细胞;细胞毒活性;肿瘤治疗中图分类号:R730.43　文献标志码:A　文章编号:1671-7414(2008)06-027-03Measurement of Cytotoxic Activity of PBMC andCIK from Cancer-bearing Patients Using LDH Release AssayZHANG Lei a,LI Fang-qiu a,ZHANG Shi-xin a,HU ANG Hai-rong b,LI De-min b(a.Institute of Clinical L aboratory M edicine,PL A;b.Dep ar tment ofCardiothor acic Surgery,N anj ing General H osp ital Command,N anj ing210002,China)Abstract:Objective　T o investigate the anti-t umor activit y of peripher al blood monouclear cells(P BM C)and CIK cells from cancer-bearing patients.Methods　PBM C fr om healthy donor s and patients w ere iso lated and w ere incubated w ith var ious types of cy tokines to generate CIK.Cyto tox ic activit y of PBM C and CIK fr om cancer-bear ing patients at diagnosis w as evaluated using an L DH release assay.Results　T he anti-tum or activity of P BM C fro m patients w as much lower t han that of healthy donor s.A fter stimulation,the cyto tox ic activity of CIK w as sig nificant incr eased,and the cytoto xic activity in CIK w as increased to the prox imat e level of these tw o g ro ups,r espectiv ely.C oncl usion　Result s show the enhancement of cy totox ic activity o f CIK cells fr om bot h healthy donors and cancer patients.L DH release assay is useful for choosing candidated patients and for estimating the indiv idual t her apeut ic efficiency of CIK.Keywords:L DH release assay;cyto kine-induced killer cell;cyto tox ic activity;tumor ther apy 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案,已经作为一种肿瘤的辅助疗法应用于临床。

ldh法和mtt法

ldh法和mtt法一、介绍在细胞实验研究中，细胞增殖和生长的检测是必不可少的。

而常用的细胞增殖和生长检测方法有许多种，其中较为常见的是LDH法和MTT法。

这两种方法都是通过细胞的代谢和细胞的状态来反映细胞的增殖和生长情况的。

二、LDH法LDH法全称为乳酸脱氢酶检测法，是利用乳酸脱氢酶的氧化还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。

该方法基于细胞膜通透性的变化，当细胞膜发生损伤或破裂时，细胞内的乳酸脱氢酶会释放到培养基中。

而乳酸脱氢酶检测法就是通过检测培养基中乳酸脱氢酶含量的变化来判断细胞是否发生了损伤或破裂，以此来推测细胞的增殖和生长情况。

三、MTT法MTT法全称为四氮唑盐（3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基-二氮杂烷）法，是利用MTT盐的还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。

该方法的原理是将MTT盐加入细胞培养液中，MTT盐通过细胞中的酶反应还原成具有紫色的甲醛样代谢产物。

而这个代谢产物则会在细胞中不断积累，从而使细胞颜色越来越深。

最后，通过检测细胞的颜色深浅来推测细胞的增殖和生长情况。

四、LDH法和MTT法的比较1.优点与缺点LDH法的优点是可以反映细胞的状态和增殖情况，适用于不同种类的细胞；缺点是需要时间较长，对细胞损伤有一定影响。

而MTT法的优点是简单易行，可作为高通量筛选的快速方法；缺点则是对细胞形态和生长状态的要求较高，对于一些较小或幼稚的细胞不适用。

2.应用范围LDH法和MTT法都常用于评估各种细胞因素（如生长因子、激素、细胞毒性物质等）对细胞生长的影响；同时也受到在细胞增殖实验和细胞毒性实验中的广泛应用。

此外，LDH法和MTT法也可应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。

3.实验难度和操作技巧LDH法和MTT法均需要一定的实验基础和耐心，但LDH法一般操作难度稍高些。

五、总结细胞增殖和生长检测方法是细胞实验研究中非常重要的组成部分。

LDH法和MTT法是两种常用的检测方法，不仅能反映细胞的增殖和生长情况，也广泛应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。

细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法

细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。

近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。

目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。

1 单个细胞水平测定CTL活性目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。

活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。

目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。

1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。

LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。

但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。

(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测之南宫帮珍创作LDH释放检测方法：a. 根据细胞的年夜小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中, 使待检测时细胞密度不超越80-90%满.b. 吸去培养液, 用PBS液洗涤一次.换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液), 将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(布景空白对比孔), 未经药物处置的对比细胞孔(样品对比孔), 未经药物处置的用于后续裂解的细胞孔(样品最年夜酶活性对比孔), 以及药物处置的细胞孔(药物处置样品孔), 并做好标识表记标帜.依照实验需要给予适当药物处置(如加入0-10μl左右特定的药物安慰, 可设置分歧浓度, 分歧处置时间, 对比孔中需加入适当的药物溶剂对比), 继续按惯例培养.到预定的检测时间点前1小时, 从细胞培养箱里取出细胞培养板, 在“样品最年夜酶活性对比孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂, 加入量为原有培养液体积的10%.加入LDH释放试剂后, 反复奏乐数次混匀, 然后继续在细胞培养箱中孵育.c. 达到预按时间后, 将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min.分别取各孔的上清液120μl, 加入到一新的96孔板相应孔中, 随即进行样品测定.准备工作：a. INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量, 取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.例如, 取20μl INT溶液(10X), 加入180μl INT稀释液, 混匀后即配置为200μl INT溶液(1X).INT溶液(1X)宜现配现用, 配置后4℃保管可于当天使用, 不宜配置后冻存.b. LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对比), 参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液.注意：LDH检测工作液必需现配现用, 配制和使用过程中均要注意适当避光.样品测定:a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液.b. 混匀, 室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动).然后在490nm处测定吸光度.使用600nm或年夜于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定.c. 计算(测得的各组吸光度均应减去布景空白对比孔吸光度)细胞毒性或死亡率(%)=(处置样品吸光度－样品对比孔吸光度) / (细胞最年夜酶活性的吸光度－样品对比孔吸光度)×100d. 可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度, 横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特按时间的半致死剂量LD50.。

乳酸脱氢酶(LDH)释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产

乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂是一种旨在通过酶联连续反应系统检测由于细胞损伤导致的细胞内稳定的乳酸脱氢酶释放到细胞外，使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑（INT）还原为红色甲臜（farmazan），即比色法定量测定酶活性，以评价活体细胞繁殖的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适用于各种药物、化学、环境因子和营养因子处理的贴壁或悬浮生长中的动物或人体细胞。

替代传统的同位素[51 Cr]释放检测的最佳选择。

产品严格无菌，即到即用，简捷敏感，性能稳定，显色清晰，检测准确，重复性好。

技术背景细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的损害或完全裂解导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中包括活性稳定的乳酸脱氢酶。

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）释放法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用下，还原NAD+反应生成的NADH，再与氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）的催化下反应生成红色生色产物甲臜（formazan），在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志：吸光值与细胞死亡或毒性程度成线性正相关。

酶联连续反应系统为：lactate dehydrogenaseNAD+ + Lactate → Pyruvate + NADHdiaphoraseNADH + INT → NAD++ Formazan（red）产品内容裂解液（Reagent A）1毫升补充液（Reagent B）1毫升反应液（Reagent C）5毫升显色液（Reagent D）1毫升终止液（Reagent E）1毫升标准液（Reagent F）20微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）避免光照；有效保证6月用户自备96孔细胞培养板：用于细胞操作的容器细胞培养箱：用于孵育反应孔板离心机：用于沉淀细胞酶标仪：用于定量检测染色后的细胞实验步骤一、贴壁细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔2 X 103至2 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在室温下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50二、悬浮细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测悬浮细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔5 X 103至5 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在30℃温度下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数）17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50注意事项1．本产品为100次（1个96孔板）操作2．操作时须戴手套3．整个操作须无菌操作4．建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值5．检测体系相应增加，试剂用量按比例相应增加：例如200微升检测体系，试剂用量增加1倍6．每孔中的培养液需100微升，避免使用周边培养孔（常常液体蒸发而减少）7．系统测试，可以加入2至5微升标准液（Reagent G）到50微升无细胞的细胞培养液里，然后按照说明书加入反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）即可8．细胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）处理9．孵育时，须避光10．染色完成后，建议即刻检测，最迟不得超过1小时11．细胞培养和处理时，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否则影响检测的准确性12．血清含有乳酸脱氢酶，建议使用浓度不要超过1％13．细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶14．酚红会干扰检测15．样品最大酶活性对照孔或最大OD吸光读数与细胞裂解程度密切相关16．如果用户没有孔板离心机，则移取上清液时格外小心17．如果用户没有匹配的波长，可以使用波长470nm至570nm之间的任一波长替代18．本公司提供系列细胞繁殖检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。

LDH释放法检测肿瘤患者PBMC和CIK细胞的细胞毒活性

ＣａｄｉｔｏａｉｒｒＮａｊｎｎｒｌＨｏｐｉｌＣｏｒｏｈｒｃｃＳｕｇｅｙ，ｎｉｇＧｅｅａｓｔｍｍａｄ，ｎｉｇ２００，ｈｎ）ａｎＮａｊｎ１０２Ｃｉａ
ＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｖｓｉａｅｔｅａｔｔｍｏｃｉｉｆｐｒｐｅａｌｏｎｕｌａｅｌＰＢＣ）ａｄＣＩｃｌｓｒｃ：ｊｃｉｖｎｅｔｇｔｈｎｉｕｒａｔｖｔｏｅｉｈｒｌｂｏｄｍｏｏｃｅｒｃｌ — ｙｓ（ＭｎＫｅｌｓ
ｆｏｍａｅ — ａｉａｉｎｔ．ＭｅｈｏＰＢＭＣｒｍｅａｔｙｄｏｒｃｎｃｒｂｅｒｎｇｐｔｅｓｔｄｓｆｏｈｌｈｎｏｒｎｄｐａｉｎｔｗｅｅｓｌｔｄａｅｅｉｕｔｄｗｉｈｓａｔｅｓｒｉｏａｅｎｄｗｒｎｃｂａｅｔｖｒｏｕｓｙｓｏｆｃｏｎｅＯｇｅｒｔＫ．ＣｙｔｔｃａｔｖｔｆＰＢＭＣｎｄＣＩｆｏａｅ — ａｒｎｇｐａｉｎｔｔｄａｇｓｓａｉｔｐｅｙｔｋｉｓｔｎｅａｅＣＩｏｏｘｉｃｉｉｙｏａＫｒｍｃｎｃｒｂｅｉｔｅｓａｉｎｏｉ
ＺＨＡＮＧｉ，ＬｅＬＩＦａｎｑｕｇ— ｉ，ＺＨＡＮＧｈｉｘｉＨＵＡＮＧＳ — ｎ，ＨａｉｒｎｇＬＩＤｅｍｉ — ｏ， — ｎ
（．ｎｔｕｅｆＣｉｉｌａｏａｏｙＭｅｉｎ，；．ｐｒｎｆ日ＩｓｔｔｏｌｃｂｒｔｒｄｃｅＰｉｎａＬｉ６Ｄｅａｔｔｍｅｏ

NK细胞毒活性-LDH释放法

Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数（cpm)，即可计算出NK细胞活性。
50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +
75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+
100ul 1% NP-40
100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
4-6
G
200ul 10% 1640
培养基对照孔
B,C,D
A
SI=
实验孔值-自然释放孔值 Max- S自发
×100%
7-9 10-12 免疫学实验
加板方法
Max=E-F S自发=A-G
·14·
结果处理
免疫学实验
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标为E:T,纵坐标为SI值。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。

靶细胞杀伤实验：LDH法

靶细胞杀伤实验：LDH法
一、效应细胞的制备
激惹5天后，于无菌条件下取出受鼠引流的腹股沟淋巴结，100目钢网研磨，调整细胞浓度为2×107.ml-1。

台盼蓝色要求存活率>95%。

二、靶细胞的制备
P815细胞株系DBA/2小鼠的肥大细胞瘤细胞株。

连续传代培养，调整细胞浓度为2×105/ml或3.33×105/ml（加入α-Lyt2 mAb时的靶细胞浓度），台盼蓝染色成活率>95%。

三、LDH释放法测定CTL的功能
按表1加样于96孔培养板中，设3个复孔。

混匀置二氧化碳培养箱中孵育4h。

室温离心，用微量加样器每孔取上清液100μl，送全自动生化分析仪测定每孔的LDH含量。

表1 LDH释放法测定CTL活性的加样情况（μl）
分组效应细
胞靶细
胞
α-Lyt2 m
Ab
1% Triton X-1
00
完全培养
基
自然释放
孔
100 100
最大释放
孔
100 100
实验孔1 100 100
实验孔2 100 60①40
注：靶细胞浓度为3.33×105/ml
四、计算CTL活性
特异杀伤率(%)=(实验孔LDH值-自然释放孔LDH值)/(最大释放孔LDH值-自然释放LDH 值)
五、统计学处理
DTH的测定，4组间比较采用方差分析，两组比较采用q检验。

对于CTL的特异杀伤率，先进行百分数的平方根反正弦转换后采用方差分析进行4组间比较，两两比较采用q检验。

细胞毒计算公式

细胞毒计算公式
细胞毒性的计算公式有多种，以下是其中两种常见的公式：
1.细胞毒性（%）=〔反应孔OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）/最大释放孔
OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）〕× 100%。

这个公式通常用于LDH释放法计算细胞毒性。

在这个方法中，首先测量不同浓度毒性物质处理后细胞的LDH释放量，然后通过酶标仪测量490 nm处的吸光度值，最
后代入公式计算细胞毒性。

2.%细胞毒性=[1-（对应浓度梯度450nm吸光度-空白培养基对照)/（未处理细胞组吸
光度-空白培养基对照）]×100。

这个公式是另一种常见的细胞毒性计算公式。

在这个方法中，也需要测量不同浓度毒性物质处理后细胞的吸光度值，但使用的是450 nm处的吸光度值，并且需要设置一个空白培养基对照和一个未处理细胞组对照。

请注意，具体的计算方法可能因实验方法、试剂和仪器的不同而有所不同。

在实际应用中，应根据具体的实验条件和要求选择适当的公式进行计算。

ldh细胞毒性检测原理

ldh细胞毒性检测原理
LDH细胞毒性检测是一种常用的细胞毒性评价方法，其原理基于乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）在细胞损伤时释放到培养上清液中。

LDH是一种催化乳酸转化为丙酮酸的酶，在正常情况下主要存在于细胞内。

当细胞发生损伤或坏死时，LDH被释放到外界环境中。

因此，通过测定培养上清液中的LDH水平，可以间接反映细胞损伤程度。

LDH细胞毒性检测的具体步骤如下：
1. 给予细胞不同浓度的试剂处理，例如药物、化合物等。

2. 处理一段时间后，将培养上清液收集并离心，得到上清液。

3. 使用LDH试剂盒，按照说明书的步骤将上清液与试剂进行反应。

4. 将反应混合物置于检测设备中，通过测定OD值或荧光信号的强度，可以得到LDH的活性或浓度。

5. 将测定结果与对照组进行比较，可以评估细胞毒性的程度。

LDH细胞毒性检测的优点在于操作简便，结果可靠，常用于评估药物、化合物对细胞的毒性影响。

然而，需要注意的是LDH的释放并不一定代表细胞的坏死，因为在一些情况下，LDH也可能通过非坏死途径释放，如胞吞作用、葡萄糖缺乏等。

因此，综合分析LDH释放的动力学变化和其他细胞毒性指标，可以更全面地评估细胞的毒性情况。

乳酸脱氢酶释放法

乳酸脱氢酶释放法
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）是一种常见
的酶，它可以将乳酸转化为乙酰胆碱和氢氧化物。

LDH是一
种重要的酶，它可以用来诊断疾病，检测肝脏疾病，心脏疾病，肺部疾病，血液疾病等。

乳酸脱氢酶释放法（LDH Release Assay）是一种通过检测释放的乳酸脱氢酶来诊断疾病的方法。

乳酸脱氢酶释放法的原理是，当细胞受到损伤或病毒感染时，它们会释放大量的乳酸脱氢酶到血液中。

因此，测定血液中乳酸脱氢酶的含量可以检测细胞损伤或病毒感染的程度。

使用乳酸脱氢酶释放法诊断疾病时，首先要收集患者的血液样本，然后将样本放置在恒温条件下，用乳酸脱氢酶试剂盒测定血液中乳酸脱氢酶的含量。

测定结果显示，如果乳酸脱氢酶含量较高，则可能表明患者患有某种疾病。

乳酸脱氢酶释放法是一种简单、快速、有效的诊断方法，可以有效检测肝脏疾病、心脏疾病、肺部疾病、血液疾病等疾病。

它可以更快更准确地诊断疾病，从而更好地控制病情，改善患者的生活质量。

乳酸脱氢酶释放法是一种有效的诊断方法，但也有一些缺点。

首先，乳酸脱氢酶释放法需要较多的实验操作，容易出错。

其次，乳酸脱氢酶释放法检测准确性受到实验室条件和技术水平的影响，容易出现误差。

总之，乳酸脱氢酶释放法是一种有效的诊断疾病的方法，它可以更快更准确地诊断疾病，改善患者的生活质量。

但是，也有一些缺点，所以在使用这种方法时，需要注意操作步骤，提高实验室条件和技术水平，以保证检测结果的准确性。

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测之阳早格格创做LDH释搁检测要领：a. 根据细胞的大小战死少速度将适量细胞交种到96孔细胞培植板中，使待检测时细胞稀度没有超出80-90%谦.b. 吸来培植液，用PBS液洗涤一次.换新陈培植液(推荐使用含1%血浑的矮血浑培植液或者适合的无血浑培植液)，将各培植孔分成如下几组：包罗无细胞的培植液孔(背景空黑对于照孔)，已经药物处理的对于照细胞孔(样品对于照孔)，已经药物处理的用于后绝裂解的细胞孔(样品最大酶活性对于照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并干佳标记表记标帜.依照真验需要赋予适合药物处理(如加进0-10μl安排特定的药物刺激，可树立分歧浓度，分歧处理时间，对于照孔中需加进适合的药物溶剂对于照)，继承按惯例培植.到预约的检测时间面前1小时，从细胞培植箱里与出细胞培植板，正在“样品最大酶活性对于照孔”中加进试剂盒提供的LDH释搁试剂，加进量为本有培植液体积的10%.加进LDH释搁试剂后，反复吹挨数次混匀，而后继承正在细胞培植箱中孵育.c. 到达预约时间后，将细胞培植板用多孔板离心机400g离心5min.分别与各孔的上浑液120μl，加进到一新的96孔板相映孔中，随即举止样品测定.准备处事：a. INT溶液(1X)的晃设：根据所需的INT溶液(1X)的量，与适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.比圆，与20μl INT溶液(10X)，加进180μl INT稀释液，混匀后即晃设为200μl INT溶液(1X).INT溶液(1X)宜现配现用，晃设后4℃保存可于当天使用，没有宜晃设后冻存.b. LDH检测处事液的配造: 根据待测定的样品数(含对于照)，参照下表正在临检测前新陈配造适量的检测处事液.注意：LDH检测处事液必须现配现用，配造战使用历程中均要注意适合躲光.样品测定:a. 各孔分别加进60μl LDH检测处事液.b. 混匀，室温(约25℃) 躲光孵育30min(可用铝箔包裹后置于火仄摇床或者侧晃摇床上缓缓摇动).而后正在490nm处测定吸光度.使用600nm或者大于600nm的任一波少动做参照波少举止单波少测定.c. 估计(测得的各组吸光度均应减来背景空黑对于照孔吸光度)细胞毒性或者牺牲率(%)=(处理样品吸光度－样品对于照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对于照孔吸光度)×100d. 可画造细胞毒性直线：纵座标为本质吸光度，横坐标为药物浓度；据此可估计该药物效率特定时间的半致死剂量LD50.。

细胞毒性实验

细胞毒性实验细胞毒性实验是一种常见的生物学实验方法，用于评估各种物质对细胞的毒性和影响。

通过细胞毒性实验可以研究药物的安全性、环境污染物的危害性以及化学物质的毒理学特性。

本文将介绍细胞毒性实验的基本原理、常用方法以及结果的解读。

基本原理细胞毒性实验基于细胞生物学的基本原理，利用细胞在体外的培养条件下对外界刺激的反应来评估物质的毒性。

在细胞毒性实验中，通常选用肿瘤细胞株或非肿瘤细胞株作为实验对象，通过给细胞暴露于不同浓度的待测物质，观察其对细胞形态、生长、代谢等方面的影响，从而判断其毒性程度。

常用方法MTT法MTT法是一种常用的细胞毒性实验方法，通过将细胞与MTT染料反应产生紫色的甲苯胺酚盐，用来反映细胞的代谢活性，从而评估细胞的存活率。

该方法操作简单、灵敏度高，常用于筛选化合物的毒性作用。

LDH释放法LDH释放法是测定细胞膜通透性的一种方法，通过测定培养基中LDH的释放量来评估细胞的损伤程度。

在细胞受到毒性物质的作用后，细胞膜破裂导致LDH的释放，因此LDH释放量的增加可以反映细胞膜的破损情况。

结果解读在细胞毒性实验中，通常会得到一系列不同浓度下的实验数据，如细胞存活率、LDH释放量等。

通过对这些数据进行统计分析和比较，可以得出物质对细胞毒性的评估结果。

一般情况下，细胞存活率越低，LDH释放量越高，说明物质对细胞的毒性越大。

细胞毒性实验是评估化合物毒性的重要手段，通过该实验可以为药物研发、环境保护和毒理学研究提供重要参考。

科学家们不断改进细胞毒性实验的方法，提高其准确性和灵敏度，希望能够为人类健康和环境保护作出更大的贡献。

细胞毒性检测的实验方案

细胞毒性检测的实验⽅案
在糖酵解的发⽣速率上，乳酸脱氢酶不是限速酶，故对发⽣速率影响不⼤。

运⽤这个原料，我们通过质膜损伤的定量评估细胞死亡或细胞毒性。

LDH是⼀种稳定的酶，存在于所有细胞类型中，并在质膜受损后迅速释放到细胞培养基中。

因此，LDH是细胞毒性研究中使⽤zui⼴泛的标记。

乳酸脱氢酶(LDH或LD)应⽤范围⾮常⼴泛：
分析化合物或环境因素对细胞死亡的作⽤。

对动物细胞样本都可以进⾏检测。

细胞个数检测范围：10,00-100,0000个细胞/孔。

操作简便：
1.⽆需绘制标准曲线，⽤阳性结果和阴性结果进⾏定量细胞毒性；
2.LDH从细胞内被释放到培养基中，形成了⼀个可视化的颜⾊反应。

加样反应显⾊之后，⽤酶标仪进⾏检测，读数便捷；
3.样本和反应器材易得：仅需要取得200 µL细胞培养上清作为样本，进⾏后续检测。

普通96孔板就可以完成。

对于乳酸脱氢酶的搭配使⽤，为了帮助检测到更多的细胞状态指标，更加全⾯的评估外界刺激对细胞的影响，Abbkine 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒（KTA1030）是⼀个不错的选择。

以上，主要讲的是细胞学研究的细胞毒性检测的实验⽅案。