大肠杆菌表达系统的研究进展

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表达宿主菌株的选 择 也 是在 原 核 蛋 白表 达 过 程 中 所 必 须 要 综合 考虑 的 很 重 要 的 因 表达宿主菌 。 — — 多数 人 会 直接 选 择 自 己 实 验 室 曾 经 用 素 但是在平时的实验中， 最容易被忽视的就是宿主 菌 的 选 择 — — — 即使表达结果不佳， 过的表达菌株， 或者是载体配套的菌株， 而不去追究原因 — 大多在表达条件和载体 上找原因， 也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主， 对外源基因的表达会产生一定的 影响， 是 勿 庸 置 疑 的。 每 一 个 宿 主细 胞 都像 一 “你给它们安排的生产任务” — — — 因为很难亲眼观察 微 观 世界 个微观的小工厂， 按照细胞固有的程序完成 中表达是如何进行的， 当出现问题时， 我们需要经验判断 问 题 所在。 比 如， 菌 株 内 源 的 蛋 白 酶 过 多， 可能会 造成外源 表 达 产 物 的 不 稳 定， 所 以 一 些 蛋 白 酶 缺 陷 型 菌 株 往往 成为 理 想 的起 始 表 达 菌 株。 堪称经典的 BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型， 也是我们非常熟悉的表达菌株。 大名鼎鼎的 BL21 ( DE3 ) 融源菌 则是添加 T7 聚合酶基因， 为 T7 表达系统而设计。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同， 因此， 在用原 核系统表达真核基因的时候， 真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子， 从而导致表 Rosetta 2 系 列 就 是 更 好 的 选 择 — — — 这种携带 达效率和 表 达 水 平很 低。 改 造 基 因 是 比较 麻 烦 的 做 法， CCC ，GGA 及 CGG ) 稀有 pRARE2 质粒的 BL21 衍生菌， 补充大肠杆菌缺乏的 7 种( AUA，AGG ，AGA，CUA， 密码子对应的 tRNA， 提高外源基因、 尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。 当要表达的蛋白质需要形 12 衍 生 菌 Origami 2 系 列， thioredoxin reductase ( trxB ) 和 成二硫键以 形 成 正 确的 折 叠 时， 可 以 选 择 Kglutathione reductase ( gor) 两条主要还原途径双突变菌株， 显著提高细胞质中二硫 键 形 成 几 率， 促进蛋白 Rosettagami TM 2 则是综合上述两类菌株 的 优 点， 可溶性及活性表达。 既 补 充 7 种 稀 有密 码 子， 又能够促进 二硫键的形成， 帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。Origami B 是衍生自 lacZY 突 变 的 BL21 菌株， 这个突变能 根 据 IPTG 的 浓 度 精确调节 表 达 产 物， 使 得 表 达 产 物 量 呈 现 IPTG 浓 度 依 赖
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10 bp 处的由 3 9 bp 组成富 即核糖体结合位点， 它是位于起始密码子 ATG 上游 3 含嘌呤核苷酸的序列。 这段序列刚好与 16 S rRNA 3 ’末端的富含嘧啶的序列互补结合而起始翻译过程， 于 1974 年由 Shine 和 Dalgarno 发现而命名为 ShineDalgarno 序列， D 序列。 简称 S原核生物中， 核糖体受 SD UAAGGAGGUGA3’ 。 SD 序列 的 结构 及其 与 起 始 密 码 AUG 序列引导从而识别 AUG 起始密码， 保守区为 5 ’ SD 与 AUG 之间 之间的距离决定了 RBS 的结合强度， 从而对翻译的效率有显著影响， 在设计的时候要注意， 相距一般以 4 1. 1. 3 10 个核苷酸为佳。 环结构增加 mRNA 的稳定性， 提高重组蛋白的产量
Low - level expression relative to other systems; leaky expression Leaky expression Leaky expression Induction cannot be performed at low temperatures; partial induction cannot be achieved Leaky expression; difficult to achieve high cell densities Not titratable; limited media options Few vectors available; catabolite repressed by glucose Limited characterization; few vectors available Not titratable
［8 ］ P tac 、P lac 等， 还有后来出现的 几 种 高 效和 特 异性 的 启 动 子 如: T7 启 动 子、ara 启 动 子、 cadA 启 动 子 等 ( 见表 1 ) 。 当细菌生长到一定时期进行诱导表 达。 用于在 这些启动子在诱导前基础表达水平很低或没有，
E. coli 中表达重组蛋白的理想启动子不仅要能指导高效转录， 保证目的蛋白的高产量， 而且还应被紧密调 控， 以最大限度降低细菌的代谢负荷和外源蛋白的毒性作 用。 这 种 启 动 子 通 常 是 可 诱 导 的， 如加入 低 成本 的化学物质或改变生长条件等。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌， 它不仅 具有 遗传 背 景 清 楚、 培 养 操 作 简 单、 转化和转 ［1 ］ 导效率高、 生长繁殖快、 成本低廉， 可以 快 速 大 规模 地 生 产 目 的 蛋 白 等 优 点 ， 而且其表达外源基因产物 表 达 的 目 的 蛋 白 量 甚 至 能 超 过 细 菌 总蛋 白 量 的 30% ， 因 此 大肠 杆 菌 是 的水平远高于其 它 基 因 表 达系 统， ［2 ］ 目前应用最广泛的蛋白质表达系统 。 本文主要对大肠 杆 菌 表 达系 统 的 组成 以及 影响 外 源 基 因 在 大肠 杆 菌系统中表达的因素作一综述， 同时对最常用的 pET 表达系统也作了简要的介绍。
［收稿日期］ 2008 － 05 － 08 ［作者简介］ 解庭波( 1981 － ) ， 助教， 硕士， 从事医学微生物学与免疫学的教学与研究工作。 男， 湖北襄樊人，
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解庭波: 大肠杆菌表达系统的研究进展 表1 E. coli 常用启动子及特点
Problems
第 5 卷 第 3 期: 医学
长江大学学报( 自然科学版) 2008 年 9 月 第 5 卷 第 3 期: 医学 Journal of Yangtze University( Nat Sci Edit) Sep. 2008 ， Vol. 5 No. 3 : Medicine
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大肠 杆菌 表达系 统 的研究 进展
解庭波
( 长江大学医学院， 湖北 荆州 434023 )
Promoter lac ( lacUV5 ) trp tac λPL T7 phoA ara cad recA
Regulation lacI，lacIq lacI，lacIq lacI，lacIq λcIts857 lacI，lacIq phoB，phoR araC cadR lexA
Induction IPTG，thermal Trp starvation IAA IPTG，thermal thermal IPTG，thermal Phosphate starvation LArabinose pH Nalidixic acid
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大肠杆菌表达系统的组成
表达载体
在设计重组表达系统时， 有许多主要的元件是必需 的。 对 于 一 个 完整 的 表 达 载 体 来说， ［3 ］ 除了插入的基因片段外， 还应该包括复制 起 点、 选 择 性 筛选 标 记、 启 动 子 以及 转 录 终 止子 。 目前已经构
［46 ］ : ① 转 录 起 始必需 的 启 动 子。 建了多种原核表达载体， 通常对原核表达载 体 的 要 求 是 由于真核基因启 动子不能为大肠杆菌 RNA 多聚酶所识别， 因此在进行真 核 基 因 表 达 时， 必 须 将 该 基 因 编码 区 的 序列 置 于
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SD 序列
转录终止子( terminator)
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外源基因结构 外源基因是指在大肠杆菌表达体系中所要表 达 的 目 的 基 因， 包括原核基因和真核 基因两大类。 其中原核基因可以在大肠杆菌中直接表达， 而真核基因与原核基因不同， 它是断裂基因， 基因 组 DNA 中的基因是不连续的， 含有内含子序列， 大肠杆 菌 对 转 录 出 的 前 体 mRNA 不 能 进 行 剪 切 形 成 有功 能的 mRNA， 故不能在大肠杆菌中直接表达， 而只能以 cDNA 的形式在大肠杆菌中表达。 而且由于真核转录 和翻译元件不能为大肠杆菌识别， 必须提供大肠杆菌识别的转录及翻译元件以保证真核基因的表达。 如真 ， ， 核基因的前导肽不能被大肠杆菌识别发生正确的剪切 因此在设计真核基因时应去除前导肽序列 必要时 换以原核的信号肽序列。 真核基因产物 除 带 有 前 导 肽 外， 许多蛋白质都是以无活性的前体蛋白的形式表 达， 通过翻译后的加工才能成为活性状态， 因此在设计基因时应从活性蛋白质编码序列开始
大肠杆菌 RNA 多聚酶所能识别的启动 子 控 制 之 下; ② 外 源 基 因 表 达 的 产 物可 能 会 对 大肠 杆 菌 有 毒害 作 用， 影响大肠杆菌的生长， 所以表达载体应带有诱导性表 达 所 需 要 的 元 件， 即有 操 纵 子 序列 以及 与之相 应 的调控基因等; ③ 翻译起始所必需的核糖体识别序列， 一般认为其核心序列 SD 序列与外源基因起始密码 13 bp 时翻译起始效率最高; ④ 外源基因需要插入到载体合适的位置上， 子之间间隔 7 所以表达载体要 有合适的多克隆位点; ⑤ 基因克隆及筛选的必备条件， 包括载体在细胞中 复 制必需 的复 制 起 始 序列、 抗性 。 筛选标记等 1. 1. 1 启动子( promoter) 启动子是 DNA 上 RNA 聚 合 酶 的 识 别 与 结 合 位 点。 它包括两小段核甘酸序 35 区的 TTGACA 和 10 区的 TATAAT， 列， 即它不仅决定转录的起始位点， 而且决定转录 的起 始 效 率， 是