二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

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遗!传 !"#"$%&’( !)*+,+-."!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!
! ! 植 物 体 内 存 在 着 种 类 众 多 *功 能 广 泛 的 蛋 白 酶 抑 制剂蛋白$它既是植物的储藏蛋白$又 能 与 其他 蛋 白 质 相 互 作 用 来 调 节 植 物 的 蛋 白 质 代 谢$更 为 重 要 的 是$它 还 是 植 物 抵 抗 昆 虫 和 病 原 菌 侵 害 的 重 要 手 段%%&)马铃薯蛋 白 酶 抑 制 剂#!KNC#"属 于 丝 氨 酸 蛋 白酶抑制剂家族$迄今为止仅在茄 科 植物 中 发现$如 马铃薯块茎%!&*伤 害 处 理 的 番 茄 和 马 铃 薯 叶 片%#&*烟 草 柱 头%$&等 部 位 可 分 离 到 马 铃 薯 蛋 白 酶 抑 制 剂#及 其 BMCP) 马 铃 薯 蛋 白 酶 抑 制 剂#有 两 个 活 性 中 心 $分 别 抑 制 胰 蛋 白 酶 和 胰 凝 乳 蛋 白 酶 活 性$所 以 抗 虫 谱 较 广%’&)前人研究表明$马铃薯 ;%< #基因的转基因烟 草%F&和转基因水稻%"&对鳞翅目害虫具有抗虫性)
(TR8:;HU+:$VTW89:;$UPC)*?8HX+$VPC789:HY8:
!<15+/-10A*BC16/715/7B/DE7/9F*-*5+?81-GF*7390183"-:1-?*3*-5$H+1-.82;01-5F*-*"-.+-**7+-.E*-5*7$ <1-,+-.’.7+?2052710@-+I*78+5B$<1-,+-.!%&&E’$E:+-1"
EFG!6!H 扩增#扩增产物的克隆及序列分析 KLM 引 物 序 列 分 别 为 K%#LL;PP;L>>;LP>;H
;L>;>>LPLP;;PP;>> 和 K!#;LL>L>P;P>;;PH LPP;>L>P;;;>LPLP>>;L $下 划 线 部 分 是 供 克 隆 用的附加酶 切 位 点 !+-1& 和 J61$ 序 列)KLM 反 应分别以 5ACP 文 库 噬 菌 体 和 基 因 组 ACP 为 模 板 进行)KLM 条件是#E$_ ’B8: ‘!E$_ %B8:HF%_ %B8:H"!_ %B8:"a#’)目标 KLM 产物经琼脂糖凝 胶电泳分离后用上海华舜公司产凝胶回收试剂盒回
分别从伤害和未百度文库害处理的马铃薯叶片中提取
总 MCP$反转录后$取%(W5ACP 为模板用 K% 和 K! 引物扩增)同时$选用一 对 看 家 基 因 延 伸 因 子 Gc%H 9%%F&的 引 物 !K# P;PLLPLLPP;>PL>PL>;LPL 和 K$LLPLLPP>L>>)>PLPLP>LL"作 为 内 参 ) EFK!6%$!7<0 的表达载体构建
与 (/不同$蛋 白 酶 抑 制 剂 不 是 毒 性 蛋 白$其 抗 虫性是由于它能与昆虫肠道内起消化作用的蛋白酶
相互作用并使之失 去 消 化 活 性$昆 虫 取 食 后 因 缺 乏 营养而滞育或死亡 所 致$因 而 昆 虫 不 容 易 对 它 产 生 抗 性 ) 同 时 $这 类 蛋 白 原 本 就 是 人 类 食 品 的 成 分 $其 转基因植物产品对人*畜等没有任何安全性 问 题 ) %%& 最新研究还表 明$马 铃 薯 KNC# 蛋 白 还 有 抗 癌 和 抗 炎的效果 ) %I& 因而克隆和研究蛋白酶抑制剂基 因 不 仅有理论意义$对当 前 农 作 物 抗 虫 基 因 工 程 研 究 也 具有实用价值)
表明$;%<#=!> 的 BMCP 在叶片中具有强烈的伤害诱导表 达 特 性)同 时$构 建 了 分 别 以 水 稻 ’?5$ 启 动 子 和 玉 米
@6+启动子驱动;%<#H!> 基因的双元载体)
关键词!二倍体马铃薯!(/01-2349:27*,+1"(蛋白酶抑制剂 # (伤害诱导
中 图 分 类 号 !RE$#! ! ! 文 献 标 识 码 !P! ! !
文 章 编 号 !&!’#SE""!!!&&’"&#S&$%"S&F
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遗!传 !"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#$%"!$!!$!&&’
研究报告
二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂#基因的克隆# 序列分析及表达载体的构建
卜庆云!武 亮!杨世湖!万建民
!南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 $江苏省植物基因工程研究中心$南京 !%&&E’"
摘!要!根据 )0:(9:J发表的四倍体马铃薯栽培种!(/01-234526*7/823"来源的马铃薯蛋 白 酶 抑 制 剂 # 基 因 序 列$
害叶脉$每!$?处 理 一 次$连 续 #1$取 受 伤 幼 叶 用 液 氮 冷 冻 后 保 存 于 SI&_ 冰 箱 备 用 ) EF<!*>;A 文库的构建
用 W8L@法提取伤诱导叶片的总 MCP)BMCP 分 离纯化试剂盒和5ACP 文库构建的试剂盒 *YPM>>Y 5ACP@82.9.35-:</.+5/8-:J8/均购自 L@-:/05? 公司) 用试剂盒 纯 化 的 BMCP 为 模 板 经 ,.8B0.0\/0:<8-: 程序合成5ACP 并与 %>/.8,NG\! 载 体 连 结) 噬 菌 体 包装提 取 物 Y9\K9\>Y W9B219,95J;8:;G\/.95/购 自 G,850:/0./05?:-@-;80<公司)自配试剂和各项操 作均严格按各公司说明书进行)
用 KLM 方法从二倍体马铃薯NOK%&%!(/01-2349:27*,+1"5ACP 文库和基因组 ACP 扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂#
的 5ACP 和 ACP$命名为 ;%<#=!>) 测 序 表 明$;%<#=!> 基 因 组 ACP 全 长 ’I&2,$含 有 一 个 %%’2, 的 内 含 子$
%!材料和方法
EFE! 植 物 材 料 二倍 体 马 铃 薯 种 NOK%&%%%$&!(/01-2349:27*=
,+1"由黑龙江省农 业 科 学 院 克 山 马 铃 薯 研 究 所 盛 万
民研究员提供)出 苗 一 个 月 时$采 取 部 分 叶 片 用 液
氮 冷 冻 后 保 存 于 SI&_ 冰 箱 作 为 对 照 ) 对 剩 余 叶 片 进 行 伤 害 处 理 $用 刀 片 划 破 植 株 上 部 幼 叶 边 缘 $不 伤
5ACP有$F!2,!除去终止密 码 子")推 测 的 ;%<#H!> 分 子 量 是 %FDFJA$等 电 点 FD&I)与 其 他 马 铃 薯 蛋 白 抑 制 剂
#同源性比较表明$核苷酸同源性高达IIQ(推测的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 为 E#Q$并 具 有 相 同 的 活 性 中 心)M>HKLM
迄今 为 止$已 有 不 同 学 者 从 马 铃 薯 *番 %E$%&& 茄 等 %%%& 材 料 中 克 隆 了 马 铃 薯 ;%<# 基 因$但 从 马 铃 薯中克隆 该 基 因 利 用 的 都 是 四 倍 体 马 铃 薯 栽 培 种
!(/01-234526*7/823"$却 没 有 利 用 占 马 铃 薯 资 源 约"$Q的二倍体种)与四倍 体 马 铃 薯 相 比 较$二 倍 体马铃薯 具 有 更 好 的 抗 虫 性 和 更 为 丰 富 的 抗 虫 资 源 ) %%!$%#& 这种 抗 虫 性 与 其 携 带 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 基 因是否有关+ 不 同 类 型 马 铃 薯 的 ;%<# 基 因 间 是 否存在差异+这种差异是否影响它们的抗虫性+为 了系统的研究这些 问 题$就 必 须 有 不 同 马 铃 薯 种 的 ;%< # 基 因) 本 文 以 二 倍 体 马 铃 薯 种 NOK%&%%%$& !(/01-2349:27*,+1"为 材 料$克 隆 并 分 析 了 马 铃 薯 蛋白酶 抑 制 剂 # 基 因 ;%<#H!>$同 时$分 别 将 水 稻 ’?5$启动子和玉米 @6+启动子驱动的;%<#H!> 基 因构建进双元载体)
收)回收片段经 !+-1& 和 J61$ 酶 切 并 与 相 同 切 口的 ,(@+<.8,/*b!S"载体 连 接$转 化 大 肠 杆 菌 菌 株 AX’’)候选克隆按常规单菌落 W( 液体培养基过夜 培养$碱 裂 解 法 提 取 质 粒 ACP$酶 切 鉴 定 插 入 片 段 分子量后待用 ) %%’& 候 选 克 隆 的 ACP 测 序 交 由 商 业 测序公司进行)经#次重复测序确认后用 ACPYPC 软件分析 ACP 序列和氨基酸序列) EFI!6:;!7<0 基因的 HJ76!H 分析
A82+)(*+#(9<01-:/?0,+2@8<?01;0:0<0Z+0:50-6/0/.9,@-81,-/9/- !(/01-234526*7/823",.-/09<0H8:?828/-.#$9 ;0:-B85ACP9:195ACP<0Z+0:50-6,-/9/-,.-/09<0H8:?828/-.# ;0:0[0.0-2/98:016.-B/?05ACP@82.9.39:1/?0 ;0:-B85ACP-6918,@-81,-/9/-NOK%&% !(/01-2349:27*,+1"+<8:;KLMB0/?-19:1:9B01;%<#H!>DC+5@0-/810<0H Z+0:58:;5-:68.B01/?9//?06+@@H@0:;/?ACP-6;%<#H!> [9<’I&2,$8:5@+18:;9:%%’2,8:/.-:9:1/[-0\-:<D5ACP [9<$F!2, !</-,5-1-:>)P:-/8:5@+101"9:1?91IIQ <8B8@9.8/3/-/?0/0/.9,@-81,-/9/-,.-/09<0H8:?828/-.#D>?0 ;%<#H!> -,0:.0918:;6.9B0 0:5-10<9%’$H9B8:- 9581 ,-@3,0,/810 [8/?9 ,.01859/01<8]0 -6%FDF JA 9:1 9 59@5+@9/01;%-6FD&ID>?0101+501,.-/08:<6.-B;%<#H!>5ACP?91E#Q ?-B-@-;3[8/?-/?0./0/.9,@-81,-/9/-,.-H /09<0H8:?828/-. # $[?85?5-:/98:/?08:/95/<8;:9@,0,/8109:1/[-95/8^0<8/0<8B8@9./-/?0,-/9/-,.-/09<0H8:?828/-.# 69B8@3D>0</-6/?0M>HKLM8:1859/01/?9/;%<#H!> BMCP8<[-+:1H8:1+5010\,.0<<8-:8:,-/9/-@09^0<D(8:9.3^05H /-.-6;%<#H!>5ACP1.-^02308/?0..850P5/8:N,.-B-/0.!’?5$"-.B98]0T28Z+8/8:,.-B-/0.!@6+"[9<5-:</.+5H /01D B,C D#).2#18,@-81,-/9/-!(/01-23 49:27*,+1"(,.-/09<0H8:?828/-. # ([-+:18:1+501
收稿日期 !!&&$ &$ #&"修回日期!!&&$ &’ !& 基金项目 !江苏省科技厅项目!编号#()!&&%#&’"%*+,,-./0123,.-405/-6789:;<+*580:50 = >05?:-@-;3A0,9./B0:/!C-D()!&&%#&’"& 作者简介 !卜庆云!%E"F’"$男$博士生(研究方向#植物基因工程 通讯作者 !杨世湖$教授$博士生导师 )GHB98@#39:;<?$&E"39?--D5-BD5:(>0@#&!’HI$#EF’%F
水稻肌动蛋白启动子 ’?5$来自于质粒 ,(U’!&$ 引自 美 国 康 奈 尔 大 学 吴 瑞 教 授),PXL!’$,(@+0H <5.8,/b*!S"$,LPY(NP%#&&$,TL%I 等 均 为 本 实 验 室 过去引进或购买后的保存材料)限制性内切酶均购