二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

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马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析

马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析近年来，随着环境条件的不断变化和全球气候变暖的影响，农作物种植遭受逆境胁迫的情况越来越严重。

作为重要的经济作物之一，马铃薯也面临着干旱、高温、盐碱等多种逆境的威胁。

为了提高马铃薯的逆境抗性，科研人员对其抗逆相关基因进行了广泛的研究。

其中，SnRK2家族被认为是马铃薯逆境抗性的关键基因家族之一。

SnRK2家族是植物中一类重要的蛋白激酶，在植物生长发育和逆境应答中发挥着重要的调控作用。

为了进一步研究SnRK2家族在马铃薯中的功能以及其在逆境应答中的调控机制，科研人员进行了马铃薯SnRK2基因的克隆及功能分析。

首先，研究人员通过生物信息学方法，在马铃薯基因组数据库中鉴定出了多个可能与抗逆性相关的SnRK2基因。

随后，通过RT-PCR技术，从马铃薯品种中分离和克隆了SnRK2基因。

经过测序验证，并与已有的马铃薯SnRK2序列进行比对，确认了克隆得到的马铃薯SnRK2基因。

接下来，为了进一步了解SnRK2基因在马铃薯逆境应答中的功能，研究人员利用基因转化技术将马铃薯SnRK2基因导入模式植物拟南芥中。

通过对转基因拟南芥的表型观察和生理指标分析，发现马铃薯SnRK2基因的导入显著提高了拟南芥的抗旱和耐盐能力。

此外，通过基因表达分析，发现马铃薯SnRK2基因在拟南芥中的导入显著激活了一系列与逆境应答相关的基因表达。

进一步的研究显示，马铃薯SnRK2基因在拟南芥中的导入还促进了抗氧化系统的活化，提高了拟南芥对逆境胁迫下产生的活性氧的清除能力。

此外，马铃薯SnRK2基因的导入还增强了拟南芥根系的生长和发育，并提高了植株的光合效率和叶片干物质积累。

这些结果表明，马铃薯SnRK2基因在植物抗逆应答中发挥重要作用，可以改善植物对逆境胁迫的适应能力。

综上所述，研究人员通过克隆和功能分析，揭示了马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族在植物逆境应答中的重要作用。

马铃薯硝态氮转运蛋白基因的克隆及表达分析

马铃薯硝态氮转运蛋白基因的克隆及表达分析南运有;吕婷婷;曹敏轩;刘恒志;陈越;陈勤【摘要】该研究以马铃薯双单倍体‘DM'为材料,克隆到高亲和性硝态氮转运蛋白基因StNRT2.1的全长cDNA(JGI登录号PGSC0003DMT400002924),并对其进行表达模式和生物信息学分析,为深入探索StNRT2.1基因的生物学功能以及提高马铃薯对氮素的利用效率奠定理论基础.结果表明:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StNRT2.1基因cDNA全长片段,并构建pCEGFP-StNRT2.1表达载体;测序结果显示其实际所编码的蛋白质序列与数据库中目的基因蛋白质序列完全一致,表明成功克隆到StNRT2.1基因且未出现错义突变.(2)StNRT2.1基因位于马铃薯第11号染色体,cDNA序列全长1 593 bp,编码530个氨基酸,预测蛋白相对分子质量约为57.60kD,理论等电点为9.36.(3)生物信息学分析显示,StNRT2.1由20种氨基酸组成,其中甘氨酸(Gly)所占比例最多,达到10.8％,并且主要由228个α-螺旋、27个β-折叠、87个延伸链和188个无规则卷曲构成;StNRT2.1存在功能保守结构MFS_1 (PF07690)和12个跨膜螺旋结构域,且N端和C端均位于细胞膜内;StNRT2.1位于质膜上且不具有信号肽,可能为非分泌型膜蛋白.(4)以氮充足(7.5 mmol/L)水平作为对照,马铃薯幼苗经无氮(0mmol/L)和低氮(0.75 mmol/L)处理3周后呈现出叶片发黄及植株矮化等明显表型差异.(5) qRT-PCR结果显示,在无氮条件下,马铃薯根组织中StNRT2.1基因表达量升高3.98倍,说明StNRT2.1可能为诱导型高亲和转运蛋白.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2019(039)004【总页数】7页(P588-594)【关键词】马铃薯;硝态氮;硝态氮转运蛋白2(NRT2);生物信息学分析;qRT-PCR 【作者】南运有;吕婷婷;曹敏轩;刘恒志;陈越;陈勤【作者单位】西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学食品科学与工程学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨陵712100【正文语种】中文矿质养分是植物正常生长发育所必需的生命物质，其中氮素(N)是植物需求量最大的元素，也是影响作物产量的关键因子[1]。

马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析

马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析蔗糖非酵解型蛋白激酶2（Sucrose non-fermenting1-related protein kinase2，SnRK2）是植物细胞内一类蔗糖非酵解型-1（SNF1）蛋白激酶，其与植物对逆境信号的响应有关。

本研究利用生物信息学方法结合同源序列克隆，从马铃薯基因组中筛选并克隆了马铃薯StSnRK2基因家族序列；利用生物信息学方法分析了基因的特性及功能；通过构建GFP融合载体对其进行了亚细胞定位；运用实时定量荧光（qRT-PCR）技术研究了StSnRK2的组织表达特性和不同逆境胁迫下StSnRK2基因家族的表达特性与生理特性；通过转化烟草，检测了转基因植株中抗逆相关基因的表达特性，初步揭示了马铃薯StSnRK2基因家族成员的功能、表达模式及可能参与的抗逆信号途径。

主要研究结果如下：1、通过生物信息学分析结合同源克隆，从陇薯3号‘中得到了8个马铃薯SnRK2基因家族的成员，分别命名为StSnRK2.1～2.8(GenBank 登录号：JX280911～JX280918)。

该基因家族核苷酸片段大小在1008～1089bp，氨基酸序列在335～362aa，等电点为4.88～6.08，分子量大小为37.44～41.49KDa。

生物信息学分析表明该基因家族成员都含有Ser/Thr蛋白激酶的核心功能域；同源序列比对分析和聚类结果显示该基因家族和已报道的拟南芥、水稻、玉米的SnRK2基因家族具有高度的同源性；根据其氨基酸序列与功能的相似性将家族成员分为3组，第一组成员包括StSnRK2.1、StSnRK2.2、StSnRK2.5、StSnRK2.7和StSnRK2.8，第二组成员有StSnRK2.4和StSnRK2.6，第三组成员有StSnRK2.3。

基因结构分析显示，该基因家族成员中仅StSnRK2.6含有7个外显子，其他成员均含有9个外显子；对其2kb的前导序列进行分析发现该基因家族8个成员含有植物抗逆相关元件ABRE、DRE和LTRE，但不同成员所含元件个数之间存在差异。

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备-精品文档

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备是马铃薯最常见的病毒之一，是马铃薯X病毒属（Potexviruses）的典型成员，1931年由Smith在马铃薯上发现，目前在世界各地均有发现。

PVX可侵染16科240余种植物，侵染茄科（Solanaceae）种类最多[1-3]。

感染PVX病毒的马铃薯可能表现出的症状有萎缩、斑驳、叶子尺寸变小和花叶等，有时也会在块茎上出现坏死斑，表现的症状及轻重和PVX株系及所侵染马铃薯的品种有关[4]。

PVX为（+）ssRNA线状病毒，基因组长度约为6.4 kb，共有5个开放阅读框架（open reading frame，简称ORF），近3′端的ORF编码25 ku病毒外壳蛋白（简称CP）[1，5-6]。

马铃薯作为世界性重要的农业资源和多种工业加工原料，受到世界各国的高度重视。

马铃薯是贵州省仅次于水稻、玉米居第3位的粮食作物[7]。

郑世玲等对贵州省马铃薯种植区的部分样品进行病毒的血清学检测，发现大部分样品为2种或多种病毒共同侵染[8]。

颜谦等对贵州省海拔500～2 500 m 之间马铃薯产区的调查结果显示，PVX危害有逐年上升的趋势[9]。

病毒的侵染除直接引起马铃薯病毒病外，更重要的是会导致种质退化，引起产量的急剧下降[9]。

目前，通过脱毒技术去除PVX病毒是防治该病毒最为有效的手段，脱毒效果需要通过间接酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunsorbent assay，简称ELISA）等检测方能确认。

笔者所在实验室已从贵州省感染PVX的马铃薯中分离出PVX-GZ，经鉴定该分离株属于PVX的X3株系[10]。

本研究采用RT-PCR等技术克隆PVX-GZ CP基因，构建原核表达载体，使其在大肠杆菌中大量表达，用获得的重组蛋白免疫家兔，制备出高效、灵敏、特异的抗血清，为PVX血清学检测试剂盒的研发奠定了良好的基础。

1材料与方法1.1试验材料植物总RNA提取试剂（RNAiso Plus）、一步RT-PCR试剂盒、BamHⅠ和HindⅢ限制酶、大肠杆菌DH5α菌株和pMD18-T克隆载体均购自宝生物工程（大连）XX公司；BL21（DE3）菌株和pET32a （+）载体、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒（potato virus Y，简称PVY）、马铃薯S病毒（potato virus S，简称PVS）、建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，简称CyMV）、齿兰环斑病毒（odontoglossum ringspot virus，简称ORSV）和辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，简称PMMoV）由笔者所在实验室保存提供；PVX（普通烟）、PVY（昆诺藜）、PVS（昆诺藜）、CyMV（曼陀罗）、ORSV（苋色藜）、PMMoV（苋色藜）病叶取自笔者所在实验室防虫温室；碱性磷酸酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（简称IgG）及显色底物碱性磷酸酯显色试剂盒（BCIP/NBT）购自碧云天（Beyotime）生物技术研究所；ELISA 显色底物对-硝基苯磷酸二钠（简称pNPP）购自索来宝（Solarbio）公司；清洁级3月龄新西兰大白兔购自贵阳医学院实验动物中心，并由其隔离饲养。

【2020生物新高考京津琼】(四)考前10天——长句应答必备,教材再巩固

(四)考前10天——长句应答必备，教材再巩固(名词解释＋教材黑体字填空＋教材结论性语句)第10天1.自由水与结合水：水在细胞中以两种形式存在。

一部分与细胞内的其他物质相结合，叫做结合水。

细胞中绝大部分的水以游离的形式存在，可以自由流动，叫做自由水。

2.生物膜系统：细胞器膜和细胞膜、核膜等结构，共同构成细胞的生物膜系统。

3.自由扩散、协助扩散与主动运输：物质通过简单的扩散作用进出细胞，叫做自由扩散。

进出细胞的物质借助载体蛋白的扩散，叫做协助扩散。

物质从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应所释放的能量，这种方式叫做主动运输。

4.科学家根据细胞内有无以核膜为界限的细胞核，把细胞分为真核细胞和原核细胞两大类。

5.一切生命活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命活动的主要承担者。

6.核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。

17.糖类是主要的能源物质。

8.动物细胞的重要储能物质是糖原，植物细胞的重要储能物质是淀粉，细胞中的重要储能物质是脂肪。

9.糖类大致可以分为单糖、二糖和多糖。

10.无机盐对于维持血浆的正常浓度、酸碱平衡等具重要作用。

11.每一个单体都以若干个相连的碳原子构成的碳链为基本骨架，由许多单体连接成多聚体。

12.细胞中大多数无机盐以离子的形式存在。

第9天1.细胞代谢：细胞中每时每刻都进行着许多化学反应，统称为细胞代谢。

2.活化能：分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量称为活化能。

3.酶：酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质。

4.脂肪是细胞内良好的储能物质。

5.细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。

26.糖类在细胞膜上以糖脂和糖蛋白的形式存在，且糖蛋白只能在膜外侧，据此可以判断细胞膜的内外侧。

7.各种膜所含蛋白质与脂质的比例同膜的功能有关，功能越复杂的细胞膜，其蛋白质种类和数量越多。

三个耐冻性不同的马铃薯野生种中FAD2基因的克隆及表达分析

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 45−53 /ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00045三个耐冻性不同的马铃薯野生种中FAD2基因的克隆及表达分析李飞1,2徐建飞1刘杰1段绍光1卞春松1Jiwan P. PALTA3金黎平1,*1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081;2 贵州省马铃薯研究所, 贵州贵阳 550006;3 Department of Horticulture, University of Wisconsin, Madison 53706, WI, USA摘要: 以3个耐冻性和冷驯化能力不同的马铃薯野生种Solanum commersonii、S. acaule和S. cardiophyllum为材料,利用RT-PCR技术克隆出不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶基因ω-6脱氢酶基因(FAD2), 分别命名为Cmm-FAD2 (GenBank登录号为KF214782)、Aca-FAD2 (KF214781)和Cph-FAD2 (KF214783)。

序列分析表明, 该基因在3个马铃薯野生种中核苷酸长度都为1326 bp, 编码441个氨基酸残基。

3个野生种FAD2基因核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明, 在18个位点的差异核苷酸中有8个位点的差异导致对应的氨基酸残基变化, 其中第11和第44氨基酸残基处, 耐冻且有冷驯化能力的S. commersonii和S. acaule有相同的氨基酸, 而冷冻敏感S. cardiophyllum的氨基酸却不同。

二级结构预测结果表明S. commersonii和S. acaule的FAD2蛋白与S.cardiophyllum FAD2蛋白的α-螺旋、延伸链和随机卷曲存在明显差异。

蛋白多序列比对和进化树分析表明, 3个马铃薯野生种的FAD2基因与番茄的亲缘关系最近, 其次是与马齿笕。

以GBSS、SSⅢ、SSⅡ基因为靶标的RNAi载体对马铃薯的转化及鉴定

以GBSS、SSⅢ、SSⅡ基因为靶标的RNAi载体对马铃薯的转化及鉴定以GBSS、SSⅢ、SSⅡ基因为靶标的RNAi载体对马铃薯的转化及鉴定摘要：马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球重要的粮食和工业原料作物之一。

本研究通过构建RNA干扰（RNA interference, RNAi）载体，以GBSS、SSⅢ、SSⅡ基因为靶标，对马铃薯进行遗传转化和鉴定，以期探讨RNAi技术在马铃薯遗传改良中的应用。

关键词：马铃薯，RNAi，GBSS基因，SSⅢ基因，SSⅡ基因引言：随着全球人口的不断增加和农业可持续发展的需求，农作物产量和质量的提高成为迫切需求。

马铃薯作为主要的粮食和工业原料作物之一，在全球范围内具有重要的经济和社会价值。

然而，马铃薯中的淀粉积累相关基因GBSS、SSⅢ和SSⅡ的功能缺陷会导致淀粉合成和积累的异常，进而影响马铃薯的产量和品质。

方法：本研究采用经典的遗传转化技术将RNAi载体导入马铃薯的胚性愈伤组织。

首先，构建了GBSS、SSⅢ和SSⅡ基因的RNAi载体，并通过PCR和酶切鉴定确定其正确性。

然后，将RNAi载体导入马铃薯的胚性愈伤组织中，通过双抗性筛选和PCR验证获得转基因马铃薯株系。

最后，对转基因马铃薯株系进行形态观察、淀粉含量测定和酶活性分析等方法进行鉴定。

结果：通过PCR和酶切分析，证实了构建的GBSS、SSⅢ和SSⅡ基因的RNAi载体的正确性。

经过双抗性筛选和PCR验证，成功获得了稳定表达RNAi载体的转基因马铃薯株系。

形态观察发现，RNAi转基因马铃薯株系的株高和叶片颜色与野生型相比没有明显变化。

淀粉含量测定结果显示，RNAi转基因马铃薯株系的淀粉含量明显低于野生型。

酶活性分析结果表明，GBSS、SSⅢ和SSⅡ基因的RNAi转基因马铃薯株系中对应酶的活性均明显降低。

讨论：本研究通过RNAi技术成功转化了马铃薯，并获得了稳定表达RNAi载体的转基因马铃薯株系。

利用RNAi技术抑制马铃薯类受体激酶基因(StRLK)表达的研究

利用RNAi技术抑制马铃薯类受体激酶基因(StRLK)表达的研究朱云;李广存;樊娜娜;于耀华;张柏顺;杨煜;晁祥建;郭宝太;金黎平;郭晓【摘要】Plant receptor-like protein kinases ( RLKs) are the subfamily of protein kinases and participate plant signal transduction. RLKs play an important role in growth, development and disease resistance in plants. In the previous study,we have obtained the potato receptor-like protein kinase gene (StRLK) from diploid potato genotype ED13 with high resistance to Ralstonia solanacearum. The specific fragment of StRLK was used to construct RNAi vector pCHFl-StRLK through the intermediate cloning vector pUCCRNAi and plants expression vector pCHFl. Then the pCHFl-StRLK was transfered into ED13 via agrobacterium-mediated transformation using the stems of ED13 as explants,and finally five transgenic regeneration lines were obtained. The five lines were tested with polymers Chains Reaction (PCR) using the specific primers ofCaMV35S promoter,and the results showed that about 500bp PCR products were got in all of them, indicats that all of the five lines are transgenic lines. RT-PCR analysis of StRLK gene expression in the five transgenic lines were also performed using the StRLK specific primers with ED 13 as control. The results showed that the StRLK gene expression were inhibited in different level in the five different lines, demonstrated that pCHFl -StRLK had played interference activity and the interference effection was related to gene insertion site in the potato genome, whichwould provide some references in the function study of StRLK gene.%植物类受体蛋白激酶( Receptor-like protein kinase,RLK)是蛋白激酶的一个亚家族,参与植物的信号转导,在植物生长发育、抗病等过程中起重要作用.在前期研究中自二倍体马铃薯高抗青枯病基因型ED13中获得了类受体蛋白激酶基因StRLK.利用StRLK基因的特异区段,以pUCCRNAi为中间克隆载体、pCHF1为植物表达载体,构建了该基因的RNA干扰载体pCHF1-StRLK.进一步以ED13的茎段为外植体,利用农杆菌介导法将pCHF1- StRLK导入ED13中,获得了5株再生植株.用CaMV35S启动子特异引物对5株再生植株进行PCR扩增,均得到大小约500 bp 的特异性条带,初步证明pCHF1- StRLK成功转入ED13.以ED13为对照,利用StRLK基因的特异引物对这5株再生植株进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因的表达在5个转基因植株中均受到了不同程度的抑制,说明导入的pCHF1- StRLK发挥了干扰活性,且干扰效果与基因的插入位点有关,为进一步研究StRLK基因的功能提供依据.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)004【总页数】5页(P18-22)【关键词】二倍体马铃薯;StRLK基因;遗传转化;RNA干扰【作者】朱云;李广存;樊娜娜;于耀华;张柏顺;杨煜;晁祥建;郭宝太;金黎平;郭晓【作者单位】青岛农业大学生命科学院,山东青岛266109;青岛农业大学生命科学院,山东青岛266109;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100;青岛农业大学生命科学院,山东青岛266109;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100;青岛农业大学生命科学院,山东青岛266109;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081;山东省农业科学院蔬菜研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜分子生物学重点实验室,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】Q78;S532.03马铃薯(Solanum tuberosum)适应性强、产量高、营养丰富,是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物,然而病害却是影响其生产的主要因子。

用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建

用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建摘要：马铃薯是全球重要的粮食作物之一，其淀粉含量直接影响其经济价值和食品加工性能。

为了提高马铃薯淀粉含量，本研究通过克隆、突变和表达载体构建的方法，研究了glgC基因对马铃薯淀粉含量的影响。

引言：淀粉是由α-D-葡萄糖分子聚合而成的多聚体，在食品加工和工业生产中具有广泛应用。

马铃薯淀粉含量的提高不仅可以提高马铃薯的经济价值，还可以改善其食品加工性能。

因此，研究马铃薯淀粉含量的调控机制具有重要意义。

方法：本研究选择了glgC基因作为目标基因，通过PCR技术从马铃薯基因组中克隆得到该基因的全长序列。

然后，在探究glgC 基因功能的基础上，利用CRISPR/Cas9系统对其进行点突变。

最后，将glgC基因和突变体基因克隆到马铃薯特异表达载体上，构建了马铃薯高表达glgC基因的表达载体。

结果与讨论：通过PCR技术成功克隆了glgC基因的全长序列，并进行了序列分析。

结果表明，glgC基因在马铃薯中高度保守，在其他作物中也广泛存在。

通过对其功能的研究发现，glgC基因参与了马铃薯淀粉的合成和代谢过程，并且基因的高表达与淀粉含量呈正相关。

通过CRISPR/Cas9系统对glgC基因进行突变后，发现突变体的淀粉含量显著降低。

通过构建表达载体并转化到马铃薯中，成功实现了glgC基因的高效表达并显著提高了马铃薯的淀粉含量。

结论：本研究通过克隆、突变和表达载体构建的方法，成功研究了glgC基因对马铃薯淀粉含量的调控作用。

研究结果表明，glgC基因的高表达可以显著提高马铃薯的淀粉含量，为进一步优化马铃薯品种以提高淀粉产量提供了理论依据。

展望：虽然本研究初步探究了glgC基因对马铃薯淀粉含量的调控，但仍需要进一步研究其调控机制以及在不同马铃薯品种中的作用。

此外，还可以通过转基因技术将glgC基因转化到其他作物中，以提高其淀粉含量，进一步探究glgC基因的功能及其应用潜力。

马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式

马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式李立芹;王西瑶【摘要】Function of StWRKY2 has not been reported.Plant WRKY proteins are found as an important class of transcription factors in recentyears,which are widely involved in biotic stress,abiotic stress and growth development regulation,and they are mainly divided into three groups.WRKY2 was cloned from potato by homology cloning, with length of the coding region 1 065 bp,encoding 355 amino acids by DNA sequencing.With the amino acid se-quence of StWRKY2 blasting in NCBI,19 homology amino acid sequences were selected to analysis conservative do-main.Amino acid analysis showed that the StWRKY2 contained 1 conserved WRKY domain (TTGACC)and be-longed to the second group of WRKY family members,and its zinc-finger structure was C-X5-C-X23 H-X-H.Phylog-eny tree results showed StWRKY2 was the most closest to SlWRKY7 (Solanum lycopersicum )with 96%similarity,and the similarity of a WRKY protein of tobacco was 86%.The protein-GST (glutathione-S-transferase) complex was obtained in Escherichia coli by using the method of prokaryotic expression.StWRKY2-GST could com-bine W-box in vivo by Electrophoretic Mobility Shift Assay analysis,but only GST protein could not combine W-box.StWRKY2-GST combination with W-box could be competed by cold probe(unlabeled probe).And the experi-ment results also showed that StWRKY2-GST could not combine mutation W-box,this suggested StWRKY2-GST combined W-box withspecificity.Analysis of StWRKY2 expression level in the root,stem and leaf tissue through the real-time fluorescence quantitative PCR,the results showed that the gene was mainly expressed in the root.Next was leaf and stem.In order to further study the possible function of the gene,potato seeding from tissue culture were treated under 10 μmol/L lowphosp horus,10 μmol/L low potassium,200 mmol/L NaCl,400 mmol/L PEG solution and 4 ℃ low-temperature treatment for 6 h,real-time fluorescence quantitative PCR showed that this gene expression level decreased significantly after low phosphorus treatment,expression of StWRKY2 increased significantly after 200 mmol/L NaCl and 400 mmol/L treatment.Expression level of StWRKY2 had no obvious change after lowpo-tassium and 4 ℃ low temperature treatment.The results indicated that StWRKY2 could in response to low phos-phorus,NaCl and PEG three kinds of abiotic stresses.These results would lay a solid foundation for further study of potato WRKY2 gene function.%马铃薯 WRKY 2基因的功能尚未见有报道,WRKY 蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用.该研究采用电子克隆法获得马铃薯 WRKY 2基因,该基因的编码区长度1065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,该蛋白属于 WRKY 家族第二组成员,锌指结构为 C-X5-C-X23 H-X-H.构建系统发育树结果表明它与番茄 WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96％,与烟草中WRKY 蛋白的相似性为86％,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白.通过凝胶阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合 W-box 元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,同时也表明StWRKY2不能结合含有突变 W-box DNA 片段,证明 StWRKY2与W-box 结合具有特异性.通过实时荧光定量 PCR 技术分析该基因在根、茎和叶中的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎.为进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L 低磷、10μmol/L 低钾、200 mmol/L NaCl、400 mmol/L PEG 溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定量 PCR 的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L NaCl 和400 mmol/L PEG 处理6 h 后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处理后表达量与对照相比无明显变化.说明 StWRKY2能响应低磷、NaCl 和 PEG 这三种非生物逆境胁迫.研究结果可为进一步深入研究马铃薯 WRKY 2基因的功能奠定基础.【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】7页(P401-407)【关键词】马铃薯;WRKY;系统发育;EMSA;表达模式【作者】李立芹;王西瑶【作者单位】四川农业大学农学院，成都 611130;四川农业大学农学院，成都611130【正文语种】中文【中图分类】Q943.2;Q812WRKY转录因子最初是从甘薯中发现的一类蛋白,当时命名为SPF1（Ishiguroet al.,1994）。

马铃薯sgt2基因启动子的克隆及其活性分析

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ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ．ＴｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｈａｄｂｅｅｎｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｔｈｅＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｏｔａｔｏｓｔｅｒｏｉｄａｌｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｓ（ＳＧＡｓ）ｉｓａｋｉｎｄｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｉｎＳｏ～
ｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｈａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳＧＡｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｐｌａｎｔ．Ａ２０９８ｂｐｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ５ｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｉｎｉｔｉａＩｃｏｄｏｎｏｆｓｇｔ２ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏ～

马铃薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及其植物表达载体的构建

［摘要］目的：克隆马铃薯腺苷酸激酶基因（ａｄｋ）并进行生物信息学分析，构建反义表达载体。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ方法从西南地区马铃薯主推品种 “ 米拉 ” 中克隆ａｄｋ编码序列，进行生物信息学分析后，反向插入植物高效表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３４０，构建其反义植物表达载体。结果：克隆到的ａｄｋ编码序列（ｓｔａｄｋ）为８６７ｂｐ，编码由２８８个氨基酸残基构成的多肽。生物信息
学分析表明，其亚细胞结构定位于质体，具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ＡＴＰ — ＡＭＰ（Ａｐ５Ａ）结合位点和ＡＭＰ结合位点，
蛋白质三维模型具有典型的ＡＤＫ蛋白立体结构。ＡＤＫ２序列的遗传相似性最高，在进化树上与杏、苜蓿、水稻的距离最近，与拟南芥的距离最远。将构建好的反义表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３４￣０－Ａｓｔａｄｋ导入根癌农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４，获得了工程菌菌株。结论：克隆到ｓｔａｄｋ基因。生物信息学分析表明，在淀粉合成水平最高的植物中，腺苷酸
“ Ｍｉｒａ ”
ｉｎｓｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｎｓｔａｄｋｗａｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＣＡＭＢＩＡ１３０４ｉｎｒｅｖｅｓｅｒｄｉｒｅｃｔｉｏｎ

利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法[发明专利]

专利名称：利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法专利类型：发明专利
发明人：胡宗利,陈国平,高建阁,张陈明,吴祥华,邓磊
申请号：CN200910191952.5
申请日：20091216
公开号：CN101717785A
公开日：
20100602
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，包括Tm-2基因的克隆及其超表达载体的构建、农杆菌的侵染转化、高抗病毒马铃薯植株的检测；本发明根据已知番茄抗病基因Tm-2抗病机理及其对病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄与马铃薯亲缘关系较近特点，采用基因工程技术将Tm-2基因转入马铃薯，并通过筛选、鉴定而获得已表达Tm-2基因的高抗病毒马铃薯植株，提高了马铃薯植株对常见病毒的抗性；本发明通过植物基因转化马铃薯，能够避免环境风险及食用安全风险，有助于把马铃薯抗病研究推向一个新的台阶，为实际应用于农业生产作出了积极探索。

申请人：重庆大学
地址：400044 重庆市沙坪坝区沙正街174号
国籍：CN
代理机构：北京同恒源知识产权代理有限公司
代理人：谢殿武
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一种通过过表达马铃薯StSN2基因诱导马铃薯快速结薯的方法[发明专利]

专利名称：一种通过过表达马铃薯StSN2基因诱导马铃薯快速结薯的方法
专利类型：发明专利
发明人：王西瑶,李立芹,彭洁,张杰,蔡诚诚,邓孟胜,杨勇,王宇,余丽萍,徐驰,梅猛,杨桂晶
申请号：CN201910436150.X
申请日：20190523
公开号：CN110079549A
公开日：
20190802
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种通过过表达马铃薯StSN2基因诱导马铃薯结薯的方法，包括：(1)构建过表达载体；(2)通过农杆菌介导构建转基因植株：①马铃薯苗的诱导；②农杆菌的活化及重悬；③预培养及共培养；④芽诱导及根诱导；(3)确定转基因株系；(4)诱导马铃薯结薯。

本发明中StSN2基因参与马铃薯块茎休眠过程，通过过表达StSN2基因来增加块茎的休眠时间，用以适应不良环境，同时通过过表达StSN2基因，可有效调控马铃薯块茎的休眠状态，而通过RNAi就能实现对马铃薯块茎休眠过程的释放，使其萌芽过程与环境相适宜，促进其快速生长，提高其产量和质量。

申请人：四川农业大学
地址：625000 四川省雅安市雨城区新康路46号
国籍：CN
代理机构：成都正华专利代理事务所(普通合伙)
代理人：郭艳艳
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二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的克隆、序列分析及表达载体的构建卜庆云;武亮;杨世湖;万建民【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2005(27)3【摘要】根据GenBank发表的四倍体马铃薯栽培种(Solanum.tuberosum)来源的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因序列,用PCR方法从二倍体马铃薯lVP101(Solanum.phurejia)cDNA文库和基因组DNA扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的cDNA和DNA,命名为PINⅡ-2x.测序表明,PINⅡ-2x基因组DNA全长580 bp,含有一个115bp的内含子,cDNA有462 bp(除去终止密码子).推测的PINⅡ-2x分子量是16 6 kD,等电点6 08.与其他马铃薯蛋白抑制剂Ⅱ同源性比较表明,核苷酸同源性高达88%;推测的氨基酸序列同源性为93%,并具有相同的活性中心.RT-PCR表明,PINⅡ-2x的mRNA在叶片中具有强烈的伤害诱导表达特性.同时,构建了分别以水稻Acf Ⅰ启动子和玉米Ubi启动子驱动PINⅡ-2x基因的双元载体.【总页数】6页(P417-422)【作者】卜庆云;武亮;杨世湖;万建民【作者单位】南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏省植物基因工程研究中心,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏省植物基因工程研究中心,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏省植物基因工程研究中心,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏省植物基因工程研究中心,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.植物抗体基因工程:Ⅲ.马铃薯Y病毒小鼠中和抗体链基因的序列分析及其植物表达载体的构建 [J], 刘德虎;陈三凤;王海扬;李刚强2.马铃薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及其植物表达载体的构建 [J], 曾令江;陈敏;潘夕春;张启堂;廖志华3.香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建 [J], 宋顺;金志强;徐碧玉;黄东梅;胡伟;李凯;许奕4.异戊烯基转移酶基因(ipt基因)的克隆、序列分析及植物表达载体的构建 [J], 张治礼;郑学勤5.马铃薯Y病毒6kD和NIa基因的克隆与序列分析及其植物表达载体的构建 [J], 项瑜;杨兰英;彭学贤;魏宁生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

马铃薯多酚氧化酶基因克隆及反义表达载体构建

1.参考王关林=植物工程
克隆多酚氧化酶; PPO Γ 是属于多基因家族编码的一种铜结合酶Λ 迄今为止Κ在马铃薯多酚氧化酶家族中Κ 已发现 6 个家族成员Κ 通过对这些基因的同源序列分析Κ 发现在铜结合区域具有很高的同源性Λ 于是Κ设计了两对引物Κ其中一对是对全长序列 PPO 基因的扩增引物Μ 另一对是对同源序列进行扩增的引物Λ PCR 扩增后Κ 经 1. 2% 琼脂糖电泳检测Κ 得到了约 1 800 bp 和 500 bp 左右的 2 个片段; 图 2Γ Λ将两种扩增产物与 PM D 218T 连接并转化大肠杆菌 Κ 共获得 214 个阳性克隆Λ 提取阳性克 E. C oli DH 5 Α 隆质粒并用 B am H 、两种 S ac 进行双酶切鉴定Κ 质粒都获得 2 条 DNA 电泳条带Κ其中一条与 Κ 另一条与 PM D 182T 载体分子量相仿; 约 2 630 bp Γ
成熟果实和蔬菜在贮藏及加工过程中出现的褐化现象是食品及食品加工业急待解决的一个问题Λ 由于褐化Κ引起产品感官不佳Κ口感不良Κ从而影响加工产品的品质和价格Κ 导致消费者购买欲下降Μ 而加工产品销售踯躅Κ 又会引起产品积压Κ 造成恶性循环Λ针对果实贮藏及加工过程中的酶促褐化问题Κ 国
Ξ
内外学者进行了一系列研究Κ最常采用的方法就是在加工过程中使用化学添加剂来改变酶的结构或使酶失活或产生竞争性抑制作用Κ以达到降低产品褐化程度的目的[ 1 ] Λ 以往Κ马铃薯加工过程中常常采用亚硫酸盐来抑制褐化Λ 但近年来由于亚硫酸盐用于生食和鲜食
C lon ing of pota to polyphenol ox ida se gene and con structing of an tisen se PPO express ion vector

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立蒋继滨; 高冬丽; 朱曦鉴; 李灿辉【期刊名称】《《种子》》【年(卷),期】2019(038)010【总页数】5页(P29-33)【关键词】CRISPR/Cas9; 二倍体马铃薯; 发根农杆菌; StCDF1基因【作者】蒋继滨; 高冬丽; 朱曦鉴; 李灿辉【作者单位】云南师范大学马铃薯科学研究院昆明 650500【正文语种】中文【中图分类】S532对植物的基因组进行定点编辑是研究基因功能和作物遗传性状改良的重要方法。

CRISPR/Cas 9系统是目前最新一代的基因组编辑技术，其工作原理是核酸酶Cas 9蛋白在向导RNA(short guide RNA，sgRNA)的引导下，对目的基因进行切割，导致双链断裂，双链DNA在修复时会引入碱基的插入、缺失等变异，从而实现目的基因的定点突变[1]。

相比于其他基因组编辑系统，CRISPR/Cas 9系统具有构建简单，成本低廉，易于在实验室实现等显著优势，因此目前已广泛应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)以及番茄(Solanum lycopersicum)[2-8]等多种植物的基因组编辑。

马铃薯是全球第四大粮食作物，遗传资源丰富，其中超过70%为二倍体马铃薯，是马铃薯作物遗传改良的珍贵资源[9]。

二倍体马铃薯相对于四倍体基因组简单、易于转化，因此在二倍体马铃薯材料中利用基因敲除等工具验证基因的功能更容易实现。

2015年，Wang等[10]在双单倍体DM中实现了对StIAA2的定点敲除；2017年，Andersson等[11]在四倍体马铃薯的原生质体中通过对StGBSS的定点突变再经过原生质体再生，获得了富含支链淀粉的马铃薯株系；2018年，Ye等[9]通过对二倍体马铃薯S. tuberosum group Phureja S 15-65中的S-RNase的定点突变获得了可自交的种质，这说明基因组编辑技术在马铃薯中的应用已经相当成熟。

二倍体马铃薯的组培再生体系建立及抗性相关基因的遗传转化的开题报告

二倍体马铃薯的组培再生体系建立及抗性相关基因的遗传
转化的开题报告
一、选题背景
马铃薯（Solanum tuberosum）是全球最重要的食用作物之一，在我国也有着广泛的种植。

然而，病虫害是制约马铃薯生产的重要因素之一。

传统的化学防治虫害及病害方法已经无法满足需求,基因工程技术为马铃薯育种提供了新的手段。

其中，遗传转化技术可直接将外源基因转入到马铃薯基因组中，从而实现对马铃薯的遗传改良。

因此，研究马铃薯的组培再生体系及其遗传转化，对于马铃薯育种具有重要的理论和实践意义。

二、研究目的
本课题旨在建立二倍体马铃薯的组培再生体系，对马铃薯进行遗传转化及抗性基因的表达分析，为今后马铃薯的遗传改良提供理论基础。

三、研究内容
1. 采用不同激素和生长调节剂对二倍体马铃薯进行组织培养，筛选出最适宜的培养基和培养条件。

2. 对培养出的愈伤组织进行诱导分化，建立马铃薯的再生体系。

3. 构建适合马铃薯的遗传转化载体，采用农杆菌介导法将目标基因转入到马铃薯细胞中。

4. 鉴定遗传转化后的马铃薯植株的稳定性和抗性表达情况。

5. 对转化后的植株进行抗性基因的表达分析及生物学特性研究。

四、预期结果
本研究将建立起适合二倍体马铃薯的组培再生体系，并成功将外源抗性相关基因转入到马铃薯基因组中。

进一步，将对转化后的植株进行抗性基因的表达分析及生物学特性研究，探讨在遗传转化过程中影响基因表达及生物学特性变化的因素和规律，形成一套可行的马铃薯遗传转化体系，为今后马铃薯抗性育种提供有力的基础数据。

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分别从伤害和未伤害处理的马铃薯叶片中提取
总 MCP$反转录后$取%(W5ACP 为模板用 K% 和 K! 引物扩增)同时$选用一对看家基因延伸因子 Gc%H 9%%F&的引物 !K# P;PLLPLLPP;>PL>PL>;LPL 和 K$LLPLLPP>L>>)>PLPLP>LL"作为内参 ) EFK!6%$!7<0 的表达载体构建
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%!材料和方法
EFE! 植物材料二倍体马铃薯种 NOK%&%%%$&!(/01-2349:27*=
,+1"由黑龙江省农业科学院克山马铃薯研究所盛万
民研究员提供)出苗一个月时$采取部分叶片用液
氮冷冻后保存于 SI&_ 冰箱作为对照 ) 对剩余叶片进行伤害处理 $用刀片划破植株上部幼叶边缘 $不伤
表明$;%<#=!> 的 BMCP 在叶片中具有强烈的伤害诱导表达特性)同时$构建了分别以水稻 ’?5$ 启动子和玉米
@6+启动子驱动;%<#H!> 基因的双元载体)
关键词!二倍体马铃薯!(/01-2349:27*,+1"(蛋白酶抑制剂 # (伤害诱导
中图分类号 !RE$#! ! ! 文献标识码 !P! ! !
(TR8:;HU+:$VTW89:;$UPC)*?8HX+$VPC789:HY8:
!<15+/-10A*BC16/715/7B/DE7/9F*-*5+?81-GF*7390183"-:1-?*3*-5$H+1-.82;01-5F*-*"-.+-**7+-.E*-5*7$ <1-,+-.’.7+?2052710@-+I*78+5B$<1-,+-.!%&&E’$E:+-1"
迄今为止$已有不同学者从马铃薯 *番 %E$%&& 茄等 %%%& 材料中克隆了马铃薯 ;%<# 基因$但从马铃薯中克隆该基因利用的都是四倍体马铃薯栽培种
!(/01-234526*7/823"$却没有利用占马铃薯资源约"$Q的二倍体种)与四倍体马铃薯相比较$二倍体马铃薯具有更好的抗虫性和更为丰富的抗虫资源 ) %%!$%#& 这种抗虫性与其携带的蛋白酶抑制剂基因是否有关+ 不同类型马铃薯的 ;%<# 基因间是否存在差异+这种差异是否影响它们的抗虫性+为了系统的研究这些问题$就必须有不同马铃薯种的 ;%< # 基因) 本文以二倍体马铃薯种 NOK%&%%%$& !(/01-2349:27*,+1"为材料$克隆并分析了马铃薯蛋白酶抑制剂 # 基因 ;%<#H!>$同时$分别将水稻 ’?5$启动子和玉米 @6+启动子驱动的;%<#H!> 基因构建进双元载体)
收稿日期 !!&&$ &$ #&"修回日期!!&&$ &’ !& 基金项目 !江苏省科技厅项目!编号#()!&&%#&’"%*+,,-./0123,.-405/-6789:;<+*580:50 = >05?:-@-;3A0,9./B0:/!C-D()!&&%#&’"& 作者简介 !卜庆云!%E"F’"$男$博士生(研究方向#植物基因工程通讯作者 !杨世湖$教授$博士生导师 )GHB98@#39:;<?$&E"39?--D5-BD5:(>0@#&!’HI$#EF’%F
与 (/不同$蛋白酶抑制剂不是毒性蛋白$其抗虫性是由于它能与昆虫肠道内起消化作用的蛋白酶
相互作用并使之失去消化活性$昆虫取食后因缺乏营养而滞育或死亡所致$因而昆虫不容易对它产生抗性 ) 同时 $这类蛋白原本就是人类食品的成分 $其转基因植物产品对人*畜等没有任何安全性问题 ) %%& 最新研究还表明$马铃薯 KNC# 蛋白还有抗癌和抗炎的效果 ) %I& 因而克隆和研究蛋白酶抑制剂基因不仅有理论意义$对当前农作物抗虫基因工程研究也具有实用价值)
害叶脉$每!$?处理一次$连续 #1$取受伤幼叶用液氮冷冻后保存于 SI&_ 冰箱备片的总 MCP 5ACP@82.9.35-:</.+5/8-:J8/均购自 L@-:/05? 公司) 用试剂盒纯化的 BMCP 为模板经 ,.8B0.0\/0:<8-: 程序合成5ACP 并与 %>/.8,NG\! 载体连结) 噬菌体包装提取物 Y9\K9\>Y W9B219,95J;8:;G\/.95/购自 G,850:/0./05?:-@-;80<公司)自配试剂和各项操作均严格按各公司说明书进行)
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遗!传 !"#"$%&’( !)*+,+-."!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!