生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量

脱色：染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。一天换2～3 次脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质色带清晰为 止。脱色时间一般约需一昼夜（注意：与上述两种染色液 相对应，也有两种脱色液）。 蛋白质分子量的求算：以样品蛋白质迁移率比照标准蛋白 质的迁移率计算样品的分子量。
六、实验结果
1、计算蛋白质样品相对分子质量
将￠15cm培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距溴酚蓝区带中心间的距
离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端(凝胶顶端)的距离（cm），按
下式计算相对迁移率Rf
蛋白样品距加样端距离(cm)
相对迁移率Rf＝
溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
列出电泳后各种蛋白质的迁移率和分子量。 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子质量lgM为纵坐标
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
丙烯酰胺
N,N’-甲叉双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶的交联结构
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲 系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓 缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品） 在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定 浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理： 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时பைடு நூலகம்蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰 胺在有引发剂（如过硫酸铵）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲
基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。丙烯酰胺的聚合 通常是由化学催化或光化学过程完成的,常用过硫酸铵、过硫 酸钾或核黄素来引发这个过程，用TEMED、3-二甲胺丙腈等作 为聚合过程中的增速剂。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
TEMED
10%分离胶 2.4ml 1.9ml
3.07ml 75 l 50l 6l
5%浓缩胶 0.85ml
0.63ml 3.45ml
50l 25 l 4 l
⑵、凝胶板的制备 ① 分离胶的制备：
按上表配制7.5ml分离胶，混合均匀后沿玻璃板将凝胶液加至长、短玻璃板 间的缝隙内，再加1ml蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板板壁 缓慢注入，约5mm高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约30min后， 凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层 的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余的水分。 ② 浓缩胶的制备：
按上表配制5ml浓缩胶，混匀后沿玻璃板将浓缩液加到已聚合的分离胶上方， 直至离短玻璃板上得约0.5cm处，轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内， 约30min后凝胶聚合，再放置20～30min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽的 槽板（梳子），用滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将电泳缓冲液倒入上、 下贮槽中，电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
向样品槽内样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，各5μl，样品Ⅳ 15μl。如样品浓度较低，可适 当增加上样量。
蛋白质分子量标准溶液加8μl/孔。
实验步骤
电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源。对于垂
直板型电泳，一般样品进胶前电流控制在15～20mA，大 约15～20分钟；样品进胶后，将电流调到25-30mA,保持电 流强度不变。待指示染料迁移至下沿约1～1.5cm处停止电 泳。 剥胶和染色：电泳结束后，取下凝胶膜，将短板玻璃撬开 后取出凝胶板。用水慢慢冲洗一下胶面。将胶置于培养皿 内，加入染色液。染色4小时以上或过夜
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长 椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白 质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和 形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的 函数。
带负电荷的蛋白质-SDS复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白 质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特 征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天 然的电荷差异。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）是一种阴 离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子 之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特 别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的 二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子 与SDS充分结合.