疏水层析填料
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
层析填料介绍
层析填料介绍摘要：一、层析填料的概念与分类1.层析填料的定义2.分类方法及常见类型二、层析填料的工作原理1.分离原理2.固定相与流动相三、层析填料的应用领域1.生物制药2.食品工业3.环境保护四、我国层析填料的发展现状与趋势1.发展现状2.技术挑战3.未来发展趋势五、结论正文：层析填料是一种具有特定孔径和分离效果的微球或膜材料，广泛应用于生物分离和纯化领域。
本文将介绍层析填料的概念、分类、工作原理、应用领域以及我国的发展现状与趋势。
一、层析填料的概念与分类层析填料是一种具有多孔结构的材料，其分离效果主要取决于固定相（填料）与流动相（样品）之间的分配系数差异。
根据分离原理和固定相的性质，层析填料可分为多种类型，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
二、层析填料的工作原理层析填料的分离效果主要依赖于样品中各组分与固定相之间的吸附和解吸作用。
在层析过程中，样品在流动相的带动下，经过填料层，各组分根据与固定相的亲和力不同，发生不同程度的吸附和解吸，从而实现分离。
三、层析填料的应用领域层析填料在生物制药、食品工业和环境保护等领域具有广泛应用。
在生物制药领域，层析填料可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化；在食品工业中，可用于天然产物、食品添加剂等的提纯与精制；在环境保护方面，可应用于水质处理、废气净化等。
四、我国层析填料的发展现状与趋势我国层析填料行业在近年来取得了显著的发展，但与国际先进水平相比，仍存在一定的技术差距。
目前，我国层析填料产业面临着技术挑战，如提高填料的分离效果、降低生产成本、开发新型填料等。
未来，我国层析填料行业将朝着高技术含量、高附加值、绿色环保的方向发展。
综上所述，层析填料作为一种重要的生物分离材料，具有广泛的应用前景。
疏水作用色谱填料研究进展
值）３ 如磷酸盐体系、 （） ２， 乙酸－ 乙酸盐体系等， 可以避
免残 留硅 醇带来 的阴离 子效应及硅基填 料的溶解 损 失 。另 外 在 酸 性 ｐ 值 下 ， 白 质 会 部 分 变 质 失 Ｈ 蛋
出现， 使得原先缓慢的疏水色谱分离技术实现快速
分 成 可 （０ 离 为 能９ ２） ， ３
２ １４ 贯穿 （ｅｆ ｉ ） ．． ｐｒ ｓ ｎ 孔基质 ｕｏ
快速 分离（ ｍｎ 的活性 回收率很高（ ＜５ ｉ） ８ ）
２１３ 聚合物基质 ．．
针对硅 胶在碱 性条 件下 易溶 解 的缺点 ， 也为 了
２２ 疏水性配基 ． ＨＣ填料的一个重要特点是配基具有很弱的疏 Ｉ
水性 ， 与蛋 白质作用很温和 ， 从而能很 好地保 留蛋 白 质的生物活性（） 水配 基的类 型 、 ２。疏 ６ 烷基配 基 的碳 链长 短都是决 定填 料疏 水性 的关键 。前面 已提到 ，
甲氧基聚乙二醇修饰的葡糖氧化酶与良他酶素的共
轭产物 。 张 仁斌 等（） 聚 乙二 醇键 合在 大 颗粒 基 质如 ３将 ３
多孔玻璃和琼脂糖软凝胶和硅胶上制成键合相可用 于蛋白质的疏水分离。其中Ｐ Ｇ１０ 键合填料 Ｅ －５０
（０ｍ） ５ｎ 有最佳分离效 能 ， 白质在此柱上 可得 ９ ％ 蛋 ０
以上的活性回收率。２ ｇ以上的蛋白质样品可一次 ｍ 注入 １０ ｍ×５ ｍ ｉ ． ０ｍ ｍ ． 分析柱中而不影响分辨率 ． ｄ
满足某些特殊场合分离的需要， 人们开发了高分子 聚合物填料， ｏａｓ ｎ５ １７ 年研究了不同 如Ｊｈｎｓ （ 于 ９４ ｏ２ ）
组成的丙烯 酰胺和 甲基丙烯酸 酯合 成的共聚物填 料 与醇脱氢酶 的疏水作用对酶活性 的影响 。
ＨＣ填料的碳链与Ｒ Ｌ Ｉ Ｐ Ｃ不同， 一般偶联密度很低，
常见的色谱填料有哪些？
常见的色谱填料有哪些？一.什么是色谱填料？：色谱填料又称为层析介质，分为亲水型色谱填料和疏水型色谱填料两种。
1.亲水色谱填料：主要适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，硅胶表面的硅羟基或其极性基团极性较强。
主要应用于药物合成化学、天然产物、精细化工、石油产品等领域的分离和提纯。
2.疏水色谱填料：在传统固定相长链根部嵌入特殊基团，该“极性嵌入基团”能够和硅胶表面的硅羟基或流动相中的水形成氢键，对硅胶基质形成一种保护作用，且减少碱性化合物与硅羟基的作用，保证了碱性化合物的良好分离，对具有复杂结构的碱性化合物表现出不同于传统反相色谱的分离性能，即不需要“使用pH>7 的流动相来抑制碱性物质的解离”的方式就可以对碱性物质实现良好的色谱保留；对复杂的样品分离，如混合物中同时具有极性、中性和非极性的化合物时，可以实现一次分离，而且抗污染能力出色；键合相流失率极低，保留性能稳定。
二.常见色谱填料种类：常见的填料种类有：C18、C8、C1、氨基、二胺基、三胺、叔胺基、季胺基、磺酸基、羧基、氰基、苯基、环氧基、氯丙基、二醇基等多种功能化填料三.色谱填料的选择：1.硅胶基质：硅胶基质是色谱填料中最普遍的基质，除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料,硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂,缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
2.氧化铝基质：氧化铝基质具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围,它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀,但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定,不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
1.高分子聚合物填料高分子聚合物填料包括聚苯乙烯—二乙烯苯共聚物、聚二乙烯苯—吡咯烷酮共聚物、甲基丙烯酸甲酯及其离子化等产品，这些高分子聚合物填料具有优异的物理和化学性能。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析填料
2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 – 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流速：1.32 ml/min样品：5 mg/3 ml– 100 µl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
疏水相互作用层析和反相层析
GE Healthcare疏水相互作用和反相层析技术原理和方法GE Healthcare生命科学产品使用手册目录简介 (9)第一章疏水相互作用层析的原理 ..............................................................................12理论情况下的疏水相互作用层析 ..............................................................................12水的作用 ............................................................................................................12蛋白结构 ............................................................................................................13可逆的相互作用 ...................................................................................................14疏水相互作用分离的步骤 .......................................................................................14分辨率 ...............................................................................................................17柱效 ..................................................................................................................18选择性 (19)第二章疏水相互作用的实践 ....................................................................................25简介 ..................................................................................................................25纯化策略（ CIPP ）中的疏水相互作用层析 ..................................................................25疏水相互作用分离的实际考虑 .................................................................................27筛选选择性 .........................................................................................................30自动的疏水相互作用填料筛选，方法开发和优化 .........................................................30手动介质筛选，方法开发和优化 ..............................................................................31样品性质和配基的选择 ..........................................................................................33盐的选择和缓冲液制备 ..........................................................................................33柱子和填料准备 ...................................................................................................38样品制备 ............................................................................................................38样品上样 ............................................................................................................39样品上样量 .........................................................................................................39样品体积 ............................................................................................................40温度 ..................................................................................................................40洗脱 ..................................................................................................................41线性梯度洗脱 ......................................................................................................41逐步洗脱 ............................................................................................................42流速 ..................................................................................................................35流速控制 ............................................................................................................44洗涤和再平衡 ......................................................................................................45分析结果和下一步 ................................................................................................45规模化放大 (46)疏水相互作用层析介质的保养 (47)问题解决 (47)理想的疏水相互作用分离：目的蛋白可以用梯度洗脱很好的分离 (47)目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差 (47)目的蛋白在梯度的末端洗脱，分辨率差 (48)目的蛋白在梯度的中间洗脱，分辨率差 (48)BioPress填料-专为生产设计的填料...........................................................................52客户定制的填料...................................................................................................52客户定制产品......................................................................................................52第3章疏水相互作用层析的介质..............................................................................53简介 (53)SOURCE：用高分辨率纯化和简单放大.....................................................................53纯化选项............................................................................................................54纯化案例............................................................................................................56进行一次分离......................................................................................................58第一次使用或长期储存后使用.................................................................................59用梯度洗脱分离...................................................................................................59用逐步洗脱分离...................................................................................................59清洗..................................................................................................................60填料性质............................................................................................................60化学稳定性.........................................................................................................61保存 (61)Sepharose High Performance：高分辨纯化 (61)纯化选择 (62)纯化案例 (64)进行一次分离 (65)第一次使用或长期储存后使用 (66)用梯度洗脱分离 (67)用逐步洗脱分离 (67)清洗 (67)填料性质 (68)化学稳定性 (69)保存 (69)Sepharose Fast Flow：用高分辨纯化，简单放大 (69)进行一次分离 (75)第一次使用或长期储存后使用 (76)用梯度洗脱分离 (77)用逐步洗脱分离 (77)清洗 (77)填料性质 (78)化学稳定性 (78)保存 (79)第四章纯化策略中的疏水相互作用层析 (79)应用CIPP (80)纯化技术的选择和组合 (80)疏水相互作用层析作为捕获步骤 (82)纯化重组人表皮生长因子（ h-EGF） (83)用于中度纯化的疏水相互作用层析 (84)纯化 Fab片段 (85)疏水相互作用层析作为精细纯化 (86)纯化重组的 Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PE553D (86)用作精细纯化的其它技术 (88)第五章反相层析：原理和方法 (89)简介 (89)术语 (92)反相层析理论 (90)反相层析分离的步骤 (91)分辨率 (93)选择性 (95)反相层析的实践 (103)填料和柱子选择 (103)洗脱液选择和准备 (104)柱子和填料准备 (107)样品制备 (107)样品上样量 (108)样品体积 (108)温度 (108)洗涤和再平衡 (110)问题解决 (110)基线漂移：平衡洗脱液 (110)纯化选项 C C2/C18:对复杂样品的高分辨分离............................................................... 113使用μRPC .........................................................................................................113分离案例.........................................................................................................114进行分离.........................................................................................................115第一次使用或长期储存后使用..............................................................................115用梯度洗脱分离................................................................................................115清洁...............................................................................................................116填料性质.........................................................................................................117化学稳定性......................................................................................................117储存 (117)SOURCE：快速高分辨分离，简单规模化放大……………………………………………………117纯化选项……………………………………………………………………………………………118纯化案例……………………………………………………………………………………………118进行分离……………………………………………………………………………………………121第一次使用或长期储存后使用……………………………………………………………………121用梯度洗脱分离……………………………………………………………………………………122清洗…………………………………………………………………………………………………122填料性质……………………………………………………………………………………………123化学稳定性…………………………………………………………………………………………124储存…………………………………………………………………………………………………124反相层析和CIP ………………………………………………………………………………………124反相层析作为捕获步骤……………………………………………………………………………125反相层析作为中度纯化……………………………………………………………………………125反相层析作为精细纯化……………………………………………………………………………125附录 1样品制备……………………………………………………………………………………126样品的稳定性………………………………………………………………………………………126样品净化……………………………………………………………………………………………127特定的样品制备步骤………………………………………………………………………………128蛋白沉淀的重新溶解………………………………………………………………………………131更换缓冲液和脱盐…………………………………………………………………………………132除去脂蛋白…………………………………………………………………………………………135除去酚红……………………………………………………………………………………………135除去小分子量杂质…………………………………………………………………………………135附录 2填充柱子填充和柱效 (137)附录 3选择纯化设备 (139)直线流速（ cm/h）和体积流速（ ml/min）之间的相互转换 (140)从直线速度（ cm/h）到体积流速（ ml/min） (140)从体积流速（ ml/min）到直线速度（ cm/h） (140)从ml/min到使用注射器.......................................................................................... 141附录4换算数据：蛋白、柱压.................................................................................141柱压...............................................................................................................141附录 5氨基酸表................................................................................................142附录 6纯化过程中的分析检测.............................................................................. 144附录 7生物样品的保存 (146)简介如图 1所示，根据生物分子的不同特性，可以用层析技术分离开。
疏水作用层析
第二部分 药学生化实验实验一. 疏水作用层析【实验目的】通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
【实验原理】疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。
O CH 2CH CH 2O OH【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计2．实验试剂（1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow（2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0+ WP ：固相支持物L ：疏水性配体S ：蛋白质或多肽等生物大分子H ：疏水补丁W ：溶液中水分子P（3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4（4）蛋白质样品溶于溶液B【实验操作】1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
疏水层析填料种类
疏水层析填料种类疏水层析填料是一种常用于色谱分析中的填料材料，它具有疏水性能，能够在分离过程中有效地分离样品中的混合物。
下面将介绍几种常见的疏水层析填料种类。
1. 碳链疏水层析填料碳链疏水层析填料是一种以疏水性为基础的填料材料。
它由具有碳链结构的有机化合物制成，具有较高的疏水性能。
碳链疏水层析填料在分离过程中能够有效地吸附和分离样品中的非极性化合物，如脂肪酸、烷烃等。
碳链疏水层析填料常用于食品、医药、环境等领域的分析中。
2. 硅胶疏水层析填料硅胶疏水层析填料是一种以硅胶为基础的填料材料。
硅胶具有较高的孔隙度和比表面积，能够提供较大的吸附表面，因此适用于分离和富集样品中的疏水性化合物。
硅胶疏水层析填料广泛应用于有机合成、药物分析和环境监测等领域。
3. 疏水性分子筛层析填料疏水性分子筛层析填料是一种以分子筛为基础的填料材料。
分子筛是一种具有特殊孔隙结构的材料，能够通过选择性吸附分离混合物中的特定成分。
疏水性分子筛层析填料主要应用于石油化工、精细化工和环境保护等领域，能够有效地分离和富集样品中的疏水性物质。
4. 疏水性聚合物层析填料疏水性聚合物层析填料是一种以聚合物为基础的填料材料。
疏水性聚合物具有较高的亲水性，能够在分离过程中选择性地吸附和分离样品中的疏水性化合物。
疏水性聚合物层析填料在生物医药、食品分析和环境监测等领域具有广泛的应用。
总结起来，疏水层析填料种类多样，每种填料都具有独特的特点和适用范围。
选择合适的疏水层析填料能够提高色谱分析的分离效果和分析灵敏度，为科研和生产提供可靠的数据支持。
在实际应用中，需要根据样品特性和分离要求选择合适的疏水层析填料，以获得准确、可靠的分析结果。
层析柱填料的分类
层析柱填料的分类层析柱填料是一种常用的分离技术，在多个领域都有广泛的应用。
根据其物理性质和化学性质的不同，层析柱填料可以分为不同的分类。
本文将对层析柱填料的分类进行详细介绍。
一、根据物理性质分类1. 吸附填料：吸附填料是层析柱中最常用的一种填料。
其主要特点是表面具有较强的吸附能力，可以与待分离物质发生物理吸附作用。
常见的吸附填料有硅胶、活性炭、分子筛等。
吸附填料在生物制药、食品加工、环境监测等领域有广泛应用。
2. 离子交换填料：离子交换填料是一种带电的固体颗粒，其表面带有正或负电荷。
离子交换填料可以与待分离物质中的离子发生离子交换作用，实现分离纯化的目的。
常见的离子交换填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子交换填料在水处理、生物制药、化工等领域有广泛应用。
3. 柱色谱填料：柱色谱填料是一种高效分离的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的分离效果。
常见的柱色谱填料有C18、C8、氨基、硅胶等。
柱色谱填料在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。
二、根据化学性质分类1. 亲水性填料：亲水性填料是一种具有亲水性表面的填料，其主要特点是对亲水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的亲水性填料有硅胶、糖凝胶、羟基磷灰石等。
亲水性填料在生物制药、食品加工等领域有广泛应用。
2. 疏水性填料：疏水性填料是一种具有疏水性表面的填料，其主要特点是对疏水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的疏水性填料有疏水性聚合物、疏水性硅胶等。
疏水性填料在有机合成、食品加工等领域有广泛应用。
3. 离子互化填料：离子互化填料是一种可以与待分离物质发生离子交换作用的填料，其主要特点是对离子性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的离子互化填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子互化填料在环境监测、药物分析等领域有广泛应用。
三、根据粒径分类1. 大孔径填料：大孔径填料是一种具有较大孔径的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的传质效果。
疏水层析填料种类
疏水层析填料种类疏水层析填料是一种常用于化学实验室和工业生产中的分离技术。
它通过利用不同物质在填料表面的亲水性和疏水性差异，实现物质的分离和提纯。
目前市场上存在多种不同种类的疏水层析填料，下面将介绍其中几种常见的填料种类。
1. 疏水树脂疏水树脂是一种常见的疏水层析填料，它具有较好的亲水性和疏水性，可用于吸附和分离含有疏水性物质的溶液。
疏水树脂通常由聚合物材料制成，表面包覆有疏水基团。
常见的疏水树脂有聚苯乙烯、聚苯乙烯交联物等。
疏水树脂具有较高的吸附能力和选择性，适用于分离不同大小和形状的分子。
2. 疏水凝胶疏水凝胶是一种由高分子材料制成的填料，其表面具有疏水性。
疏水凝胶的特点是具有高比表面积和较大的孔隙度，可以提供较大的吸附容量和分离效果。
常见的疏水凝胶有聚丙烯酸甲酯凝胶、聚乙烯醇凝胶等。
疏水凝胶的优点是具有较高的化学稳定性和机械强度，适用于工业生产中的分离和纯化过程。
3. 疏水陶瓷疏水陶瓷是一种新型的疏水层析填料，它由陶瓷材料制成，并在表面涂覆一层疏水性物质。
疏水陶瓷具有良好的化学稳定性和机械强度，可耐受高温和酸碱环境。
疏水陶瓷的孔隙结构和比表面积可调控，适用于不同分子的分离和纯化。
疏水陶瓷广泛应用于生化、制药、环保等领域。
4. 疏水纤维疏水纤维是一种以纤维材料为基础的疏水层析填料。
疏水纤维具有较大的比表面积和良好的吸附性能，可用于分离和纯化溶液中的目标物质。
疏水纤维可采用不同的纤维材料制成，如聚丙烯、聚乙烯、聚酯等。
疏水纤维的优点是易于制备和使用，适用于小规模实验室和工业生产中的分离需求。
总结起来，疏水层析填料种类多样，不同的填料适用于不同的分离和纯化需求。
选择适合的疏水层析填料可以提高分离效果和纯化效率，为实验和生产过程提供便利。
随着科学技术的不断发展，疏水层析填料的种类还将不断更新和发展，为分离科学领域带来更多的应用和突破。
层析填料选择
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
12 / GE /
Superose系列填料
－分离范围最宽广的高分辨率凝胶过滤填料
•Superose 6分离范围：5k-5000K •Superose 12分离范围：1K-300K
13 / GE /
吸附层析填料设计
基架
配基
O S O O
•机械稳定性 •化学稳定性
•色谱模式 •选择性 •载样量 •化学稳定性
MabSelect™ Blue Sepharose Etc
26 / GE /
CaptoTM adhere
－－多模式新型强阴离子交换填料
OH OH O N
+
+
CaptoTM High flow agarose
O
OH
N-Benzyl-N-methylethanolamine
Removal of Leached Protein A Dimers and aggregtes Host cell proteins Viruses Nucleic acids ... preferably in flowthrough mode. High load in flow-through mode (100 - 300 mg MAb/ml) Contaminant removal to formulation level in two chromatographic steps
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析原理，也称为非极性层析原理，是一种分离和纯化化合物的常用方法。
该原理利用化合物在疏水性固定相（如疏水性硅胶）和溶剂中的亲水性差异来进行选择性分离。
在疏水层析中，化合物混合物首先通过一个填充有疏水性固定相的柱子（如硅胶柱）；然后用一个选择性的溶剂进行洗脱，使得各种化合物可以以不同的速度从柱中流出。
疏水性固定相作为分离介质，最主要的特点是表面疏水性强，与非极性或疏水性化合物具有较好的相互作用能力。
这种相互作用可以通过范德华力、氢键等进行，使得疏水性化合物被相互作用力留在柱上。
而亲水性化合物则更容易与溶剂发生作用而从柱中洗脱。
在进行疏水层析时，溶剂的选择是非常重要的。
选择的溶剂应该足够强大，可以与疏水性化合物发生相互作用，从而实现其分离。
常用的溶剂包括乙腈、甲酸乙酯、异丙醇等。
总之，疏水层析原理是通过利用化合物在疏水性固定相和溶剂中的亲水性差异，实现化合物的选择性分离。
这种方法在分析化学和生物化学等领域中广泛应用，能够有效地纯化和分离化合物。
疏水层析影响因素解析
疏水层析影响因素解析1. 疏水层析填料的选择*不同的配基的疏水填料与蛋白的结合能力强弱不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。
Butyl-S（苯基）（从左往右疏水性增强）*同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用力也不同，筛选填料时也要对不同的配机密度的疏水填料进行对比筛选。
2. 样品的性质蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布，同时与样品缓冲液的离子强度，离子种类，pH,所处的温度都有一定的关系，在进行疏水层析时要保持恒定的温度，且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度，pH进行筛选对比分析。
3. 层析柱反压升高或柱效下降（1）确保压力的升高是由层析柱引起的检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。
（2）层析柱使用过程杂质的积累对填料进行清洗：先用0.5M的氢氧化钠洗1CV,然后用去离子水把碱洗掉（5CV),之后在用30%的异丙醇洗1CV，异丙醇洗完后用去离子水洗5CV，上样1CV 1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5CV 0.2M NaOH清洗，再用4CV去离子水清洗。
（3）柱床太高疏水层析装填高度建议在10-20cm，大于20cm反压增大。
（4）流速过快使用适当的流速。
（5）层析填料被污染或老化随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。
此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
4. 层析柱进气泡大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。
5. 洗脱时没有收到目标物质或者洗脱量太少(1) 目标物没有与介质结合或结合量较少先确认目标物质是否和填料结合(2) 洗脱时间不够降低流速，延长洗脱液的保留时间(3) 目标物质和填料结合强度太高降低平衡液中盐浓度或更换盐的种类或或更换结合能力较弱的疏水介质在洗脱液中加入添加剂（少量去污剂或者低浓度有机试剂）(4) 层析缓冲液及温度确保疏水层析时的温度适宜，且选择合适的缓冲液。
丁基疏水层析填料
丁基疏水层析填料丁基疏水层析填料是一种常用于分离和纯化化合物的填料材料。
它的主要特点是具有疏水性，能够与水相相互排斥，从而实现对溶液中目标化合物的选择性吸附和分离。
我们来了解一下丁基疏水层析填料的原理。
丁基疏水层析填料的疏水性是由丁基烷基链引入填料表面所实现的。
这种疏水性使得填料在水溶液中具有高度的亲疏水选择性，能够选择性地吸附目标化合物，并与其他化合物区分开来。
当溶液通过填料时，疏水性相似的化合物会通过填料较快，而疏水性不同的化合物则会被填料吸附，从而实现了目标化合物的分离纯化。
丁基疏水层析填料具有较大的比表面积和孔隙体积。
这使得填料具有较高的吸附容量和分离能力。
大的比表面积可以提供更多的吸附位点，从而增加了填料对目标化合物的吸附量。
而丰富的孔隙体积则可以提供更大的分子尺寸选择性，使得填料能够分离不同尺寸的化合物。
丁基疏水层析填料具有良好的化学和物理稳定性。
它能够在较宽的pH范围内稳定运行，适用于多种溶液体系。
同时，填料具有较好的耐压性和耐高温性，能够在高压和高温条件下进行层析操作，提高操作效率和分离效果。
丁基疏水层析填料的应用范围非常广泛。
它可以用于生物制药、制剂开发、天然产物分离和纯化等领域。
在生物制药中，丁基疏水层析填料常用于蛋白质纯化和寡核苷酸富集。
在制剂开发中，它可以用于药物配方的优化和药物杂质的去除。
在天然产物分离和纯化中，丁基疏水层析填料可以实现对天然产物中复杂混合物的高效分离和纯化。
丁基疏水层析填料作为一种常用的分离和纯化材料，在化学和生物制药领域发挥着重要作用。
它通过利用疏水性和孔隙结构的特点，实现对溶液中目标化合物的选择性吸附和分离，为研究和生产提供了一种有效的工具。
随着科学技术的不断进步和发展，丁基疏水层析填料将在更多领域展现其独特的优势和应用前景。
疏 水 层 析
7、 柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。
8、 上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。
2、 柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧）
13、 好了，就这么多，有什么问题再讨论吧。或者到丁香园去问一下，chromatography很内行的！
疏 水 层 析
1、 疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。
3、 注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！
第09章疏水层析高等教学
高级教育
29
添加剂可以用来改善选择性和分辨率。 例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧 时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋 白失活或/和变性的可能。添加剂可以通过促 进蛋白溶解性，改变蛋白构象，促进结合着的 蛋白的洗脱来影响分离。水溶性醇、去垢剂等 是疏水相互作用层析中最广泛使用的添加剂。
高级教育
34
Washing out unbound material
1. Equilibration 2. Sample application
3. Washing
4. Elution
Non-bound proteins
Abs
Conc. salt
高级教育
35
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing
高级教育
5
就球形蛋白质的结构而言，
其分子中的疏水性残基数是从
外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包
埋在球形蛋白内部，有些则暴
露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌酶。
最疏水部分是深红色,浅红色的更少的 疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的, 更少的亲水部分是浅蓝色。
高级教育
28
三、缓冲液
▪ 对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致 关重要。最经常使用磷酸缓冲液。
▪ pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。 ▪ 然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5
对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。
▪ pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或 低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，在分析实验室和工业生产上得到广泛应用。
为了确保疏水层析实验的准确性和可重复性，制定一份标准操作规程是非常重要的。
下面是一份疏水层析标准操作规程的范例，供参考：1. 实验仪器和试剂准备a. 确保疏水层析仪器处于正常工作状态，如：泵、检测器、进样器等。
b. 准备好所需的疏水层析柱，并按照设备要求进行装填和平衡。
c. 检查所需的试剂和溶剂，并确保其纯度和足够的储备量。
2. 样品准备a. 准备样品溶液，并确保其浓度和体积满足层析条件。
b. 如有需要，对样品进行预处理，如：过滤、稀释等。
3. 层析条件设置a. 根据实验目的选择合适的层析模式，如：梯度洗脱、等温洗脱等。
b. 设置合适的流速和流程控制参数，如：流速、柱温、洗脱梯度等。
4. 进样和分析a. 进样前，确保进样器和进样管道的清洁，并采取适当的方法进行样品进样。
b. 监测并记录层析进程中的关键参数，如：流量、波长、保留时间等。
c. 根据实验目的和样品特性，选择合适的检测方法和条件，如：紫外检测器、荧光检测器等。
5. 数据处理和结果分析a. 根据标准操作规程的要求，对实验数据进行处理和分析。
b. 记录实验结果和关键数据，如：峰面积、保留时间、峰高等。
c. 如有需要，进行数据统计和结果验证，如：重复实验、平均值计算等。
6. 清洗和维护a. 实验结束后，对层析柱和仪器进行及时的清洗和维护。
b. 根据实验室和生产要求，定期维护和校准仪器，确保其正常工作。
7. 安全注意事项a. 遵守实验室和工作场所的安全规定，佩戴适当的个人防护装备。
b. 注意有害物质的操作和处理方法，如：有机溶剂、毒性试剂等。
通过制定和遵守疏水层析的标准操作规程，可以确保实验的准确性和结果的可靠性，提高实验效率和数据分析的可重复性。
同时，规范操作也有助于确保人员的健康安全和实验室环境的保护。
TOYOPEARL HIC 系列疏水填料使用说明书
疏水填料TOYOPEARL HIC系列使用说明书东曹株式会社安全注意事项［注意标签］■远离火源使用易燃溶剂时，请务必小心。
否则可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■使用环境必须通风良好如果通风不良，易燃或有毒溶剂可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■请勿喷洒溶剂溶剂发生喷洒或泄露可能会导致火灾、触电、中毒、受伤以及腐蚀。
清除漏出的溶剂时，请佩戴合适的护具。
■请佩戴护目镜和防护手套有机溶剂和酸属于有害物质，切勿直接接触皮肤。
■请小心处理包装处理不当可能会导致产品破裂或溶剂飞溅。
■请勿将本产品用于其他目的本产品仅可用于分离和提纯。
请勿用于其他用途。
■请确认化合物的安全性请确认分离和提纯后的化合物和溶剂安全可靠。
■正确废弃请根据当地法律法规正确废弃。
注■请妥善保管本说明书，以便日后参阅。
注意事项：出厂溶剂TOYOPEARL HIC系列疏水填料出厂时保存于20 %乙醇水溶液中。
注意事项：TOYOPEARL填料TOYOPEARL产品含甲基丙烯酸聚合物易燃性填料。
目录1. 简介 (1)2. 使用步骤 (2)3. 保存 (3)4. 备注 (3)1. 简介TOYOPEARL Ether-650、Phenyl-650、Butyl-650、Hexyl-650、SuperButyl-550、PPG-600、Phenyl-600及Butyl-600属于疏水作用层析填料（HIC）。
主要通过将疏水基团结合在TOYOPEARL HW-65（650系列、蛋白质排阻界限5×106）、TOYOPEARL HW-55（550系列、蛋白质排阻界限7×105）或孔径位于HW-65和HW-55之间的中等孔径（600系列）的TOYOPEARL HW基质上。
HIC填料可以在相对低盐浓度的缓冲溶液中吸附水溶性蛋白质。
〈产品一览〉＊注（粒径）S：超精细20～50 μmM：中等40～90 μmC：粗50～150 μm2. 使用步骤2-1 小颗粒去除（1）将500 mL的HIC填料注入3000 mL的烧杯中。
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2008-6 Volume 8
疏水层析填料
疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为
在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下
图：
填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性
蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）
色谱柱：8.2 x 150 mm
柱体积：8 ml
流动相：2.0 - 0.0M
Ammon ium Sulfate
in 0.01M phosphate, pH 7.0
流速：1.32 ml/min
Asahipak NH2P 色谱柱是Shodex 公司生产的用于分析糖类物质的正相柱
色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在
pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基
材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱 Asahipak NH2P ，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种 应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外， Asahipak NH2P 可用于定量分析；还可 以用碱性溶剂冲洗
聚合物基材氨基柱与硅胶基材 氨
基柱的柱寿命比较 左图为
Asahipak NH2P
色谱柱与硅胶基材氨基柱的寿 命对比试验。
结果显示：随着 使用时间的延长，硅胶基材氨 基柱对单糖、二糖的保留快速 下降，其原因应是硅胶基材氨 基柱的氨基降解所致。
色谱柱：Asahipak NH2P-50
4E,
其它公司的氨基柱
2008-6 Volume 8
样品：5 mg/3 ml 100 卩 l
Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）
Asahipak NH2P
(4.6mmlD*250mm)
Asahipak NH2P 色谱柱可在正相模式下分离糖类物质， 糖类物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗
脱。
增加洗脱液 中有机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。
Asahipak
NH2P 色谱柱可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇 混合物。
右图为Asahipak NH2P 色谱柱分离单糖、二糖及三 糖混合物的应用实例。
单糖、二糖及三糖混合物的分离
1
色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmlD*250mm) 流动相：H2O/CH3CN=25/75 流速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱温：30度
2008-6 Volume 8
学习园地
导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案
第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是
HPLC 系统导致的压力上升。
由于HPLC 系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力 上升，所以，应先对HPLC 系统进性排查。
CH3CN/H2O=75/25
流速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱温：30度
b Fructose
D
C- Glucose Sucrose e Maltese f. Raffitw» e
10
20
30 mir
排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。
如果此时HPLC 系
统压力正常，则考虑是柱压升高。
第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。
一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。
如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的柱压升高导致的。
排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。
第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。
如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能更换色谱柱了。
如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考
常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）
使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。
如果您使用的流动相是乙腈：水
（70:30 ），请使用更高浓度的乙腈水溶液进行清洗，比如乙腈：水（80:20 ）或乙腈：水（90:10 ）但是，如果高浓度的乙腈水溶液导致样品溶解困难的话，请停止使用上述流动相，转而使用对样品易溶的流动相。
如果该方法仍不见效，请试用下述方法。
色谱柱清洗方法（反向冲洗）
将色谱柱反向连接（即与色谱柱上箭头标识相反的方向使流动相由出口处流入、入口处流出）输送流动相试试。
此时，如果柱压太高会对色谱柱造成损坏，所以请将流速调至平时操作时的一半。
但是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱压还低的话，可能会发生色谱柱入口处的填料在筛板处聚集，那么就使用原有流速进行反洗。
反洗流动相的选择与上述正向冲洗相同，请选用比平时使用的流动相溶解性更强的、更易溶解样品的流动相。
注意，反洗时请断开检测器的管路连接，以避免污染检测器。
反洗色谱柱容易对色谱柱造成伤害，不到万不得已不要轻易使用。
本期的内容就先介绍到这里，欢迎大家各抒己见，希望以上内容能对大家的学习工作有所帮助。