固定与固定液
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一、固定与固定液
(一)固定:将新鲜的活组织从生物体取下后,立即投入固定剂中,借助化学药品的作用,使细胞保持原有形态、结构的一种手段。
1.目的
(1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败,尽量保持生长状态结构。
(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质,以保持生前的形态。
(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率,便于观察和鉴定。
(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力,便于染色。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀,失去原有的形态结构。
2.时期
(1)有丝分裂:有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织,根尖取材容易,操作和鉴定方便。
(2)减数分裂:选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。
小麦:在植株开始挑旗,旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm,花药长度大致在1-2mm左右,黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早,花药为黄色,则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。
玉米:一般夏玉米在7月份取材,以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉,表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀,切口长10-15cm,剥出雄花序,顶端花药长3-5mm,花药尚未变黄时取材。
蚕豆:从现蕾开始,上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上,由外而内。
3.固定时的注意事项
(1)固定液量:20倍于材料的体积,以免固定液被稀释。
(2)选择合适的固定液:渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中,又不使组织过度收缩或膨胀。
(3)固定的时间要合适:
与材料的大小和温度有关:材料大则时间长,材料小则时间短;温度高则时间短,温度低则时间长。
经固定的材料如不及时使用,可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时,再换入一次70%酒精,在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次,效果较好。
(二)固定液 固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液,如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好,而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液,如卡诺氏固定液等。
1.固定液的条件
(1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。
(2)必须具有渗透力,对组织各部分的渗透力相等,可使组织内外完全固定。
(3)尽可
能避免使组织膨胀或收缩。
(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。
(5)增加细胞内含物的折光程度,易于鉴别。
(6)增加媒染作用和染色能力。
(7)使组织变硬,具有一定的硬度。
(8)固定以后能起到保存的作用。
(9)在凝固原生质以后,增加细胞对于各种穿透的抵抗力,不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。
2.常用的几种固定液
(1)酒精:有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白,但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快,渗透力强,对组织收缩较大(可收缩20%左右),可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中,但由于它本身是一种还原剂,很容易氧化成乙醛,甚至氧化成醋酸,因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合,用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂,故不宜用来固定脂类材料。
(2)甲醛水溶液:甲醛在水中的溶解度为37-40%,渗透力强,固定均匀,对组织收缩作用小,一般用于固定大材料。市售溶液中含量下降,因形成三聚甲醛而失效。
(3)冰醋酸:纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶,所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5%的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用,对核蛋白固定好,可与水、酒精、氯仿混合。
(4)AF液:90ml乙醇+10ml甲醛 用于固定大块组织。
(5)卡诺氏固定液: 冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6
改良卡诺氏固定液: 冰醋酸:无水乙醇=1:3
根尖固定时,固定液可迅速杀死细胞,并保持细胞不变形,维持生活时的状态。
小资料
一、细胞器的分配问题:
细胞的有丝分裂中,细胞核内染色体的“复制和均分”,从而使亲子代体细胞保持染色体数目恒定。那么,有丝分裂细胞质中的细胞器又是如何分配呢?
实验证明:细胞分裂成两个子细胞时,不仅获得了成套染色体,也获得了细胞中的各种细胞器。子细胞获得的细胞器,只能通过原有的细胞分裂增生,它们不能在细胞质中重新产生。
例如,线粒体在细胞分裂时也分裂一次,子细胞就得到一份线粒体。高尔基体和内质网是在细胞分裂时,破成碎片或小泡,再分别进入子细胞中。
各种细胞器的增生,都是在细胞分裂之前的间期发生的。细胞器在子细胞中的分配不是平均的。
二、细胞固定和固定液:
观察植物细胞有丝分裂常用洋葱根尖做实验材料。为保证实验时能观察到较多的有丝分裂各期的分裂相,必须在根尖细胞处在分裂高峰时剪取。但往往实验课时间与分裂高峰期不合,如分裂相很少,必然影响观察效果。为此,可将处于分裂
高峰时的新鲜洋葱根尖进行固定处理,留待实验时随时使用。
固定液的种类很多,制作洋葱根尖细胞分裂装片,使用的是卡诺固定液。配方是:3份95%酒精与1份冰醋酸配制而成。把根尖投入盛有固定液的容器内,盖上盖子固定12~24小时,然后从固定液中取出,用90%酒精漂洗,最后放入70%酒精中保存,备用。
根尖固定时,固定液可迅速杀死细胞,并保持细胞不变形,维持生活时的状态。
三、碱性染料:
碱性染料的显色基团含有阳离子或本身为阳离子,能与组织或细胞中呈酸性的结构(如细胞核)发生化学结合或吸附作用,使其染上一定颜色的染料。常用于植物细胞核染色的碱性染料有:龙胆紫洋红等。
龙胆紫溶液的配制:将0.5克龙胆紫溶解在100毫升,2%醋酸溶液中配制成0.5%龙胆紫溶液。
醋酸洋红溶液的配制:将1克洋红与100毫升冰醋酸混合后煮沸,煮时可加锈铁钉一枚,略具铁质的1%醋酸洋红染液能增强染色效果。