实验2荧光显微镜的使用ppt课件
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次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它 吸收荧光染料后也可以产生荧光，称为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙， DAPI均可检测细胞内的核酸。
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荧光显微镜的基本结构组成 一、光源
由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强 度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名 为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长 530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如 美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。
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什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能
状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质 保持固有的荧光特性 n荧光波长＞激发波长 n荧光强度极小于激发光的强度 n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
激发滤色镜
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实验原理 某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较
长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜
系统放大以观察标本的荧光图像。
部分。 在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的
凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可
点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
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二、滤色镜系统 滤色镜按用途或功能，主要分为两类：
1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，
长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
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透射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理 目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
来自百度文库
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
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二、滤色镜系统 3、二向色镜（DM） 二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直
光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中。与照明光路成45°角，承担色光的分 流作用。
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光），有很高的反射率 。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率，即二色向镜起着 反射激发光和透过荧光的重要作用。
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳 定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量 氩氖混合气体。
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一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水 银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低
的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要
等15min。
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一、光源 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个
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二、滤色镜系统 一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色镜、二向色镜、阻挡滤色镜
（三部分组成。 通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片的相应组合，可以形成多种
不同的激发方法，如紫外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些名称 是以激发光主波长的颜色而定的）。
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发 射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工 作环境温度不宜太高。
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一、光源 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一
线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的
透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。
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二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃 ，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母 ，G是玻璃的第一个字母；
细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
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实验二 荧光显微镜的使用
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实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。
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实验用品
片。
荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装
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实验原理 荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和
光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波
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荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是 利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的 称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可 发出红色荧光。
同时阻挡对激发荧光无关的光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸
收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
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二、滤色镜系统 2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激发光和某些波长较短的光
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荧光显微镜的基本结构组成 一、光源
由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强 度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名 为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长 530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如 美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。
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什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能
状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质 保持固有的荧光特性 n荧光波长＞激发波长 n荧光强度极小于激发光的强度 n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
激发滤色镜
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实验原理 某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较
长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜
系统放大以观察标本的荧光图像。
部分。 在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的
凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可
点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
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二、滤色镜系统 滤色镜按用途或功能，主要分为两类：
1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，
长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
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透射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理 目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
来自百度文库
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
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二、滤色镜系统 3、二向色镜（DM） 二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直
光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中。与照明光路成45°角，承担色光的分 流作用。
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光），有很高的反射率 。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率，即二色向镜起着 反射激发光和透过荧光的重要作用。
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳 定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量 氩氖混合气体。
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一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水 银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低
的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要
等15min。
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一、光源 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个
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二、滤色镜系统 一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色镜、二向色镜、阻挡滤色镜
（三部分组成。 通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片的相应组合，可以形成多种
不同的激发方法，如紫外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些名称 是以激发光主波长的颜色而定的）。
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发 射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工 作环境温度不宜太高。
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一、光源 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一
线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的
透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。
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二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃 ，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母 ，G是玻璃的第一个字母；
细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
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实验二 荧光显微镜的使用
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实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。
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实验用品
片。
荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装
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实验原理 荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和
光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波
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荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是 利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的 称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可 发出红色荧光。
同时阻挡对激发荧光无关的光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸
收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
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二、滤色镜系统 2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激发光和某些波长较短的光