啤酒酵母选育1

啤酒酵母选育项目

紫外诱变及其突变株的性能测试

1材料与方法

1.1材料

菌种：四铃啤酒酵母

仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。

培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）

1.2试验方法

1.2.1酵母菌的活化

取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。

然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养48h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。

1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定

1.2.2.1菌悬液的制备

取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。

取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。

（此图视为参考）

1.2.3紫外线诱变试验

用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)

备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。

2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。

3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。

实验步骤：

打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。

1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28℃活化培养14h。

2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度。

3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对照。

4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。

5 30W紫外灯下30cm处照射，调整照射时间。

本次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）

6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。（选在75%-80%）。

致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数

未经紫外照射菌落数

7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，

28℃培养20h左右，计算其突变率和致死率。（上述时间等数字视为参考数值）

1.2.3.1初筛

诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

1.2.3.2复筛

供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。（麦芽汁固体培养基）

双乙酰含量测定：

初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4 株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3 和FB-E4 。结果见表1

表1 发酵液中双乙酰含量的比较

菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4

双乙酰含量 (mg/L) 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870

降低率(%) 0 42.7 24.9 37.1 29.4

（此处绘制表格样式视为参考）

双乙酰代谢的控制：

1.降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量

措施：改良酵母菌种

提高麦汁中α-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性

2加速双乙酰的还原

措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）

提高还原温度（封罐后高温还原）

限制后期酵母的出芽率（封罐）

国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求

二级啤酒：0.2mg/moL 一级啤酒：0.13mg/moL

方法：国标GB4927-2001检测

培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。

原理：双乙酰的测定方法采用比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。

1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL

2试剂和溶液

盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）

消泡剂

3实验步骤

(1)把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。

(2)将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。

(3)加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。

(4)于100mL量筒中加入2

~

4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。

(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。

(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。

(7)分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖，混匀。

(8)在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对照测定样品吸光度。

(9)计算：双乙酰(mg／L)＝A335×2.4（用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）

注：若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.2

1.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO

2

失重法）

将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，所以

只需计算发酵后单位时间内CO

2的释放量，发酵6d，以CO

2

产生量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制C0

2

产生量曲线。

1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定

从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。附录：硫酸-苯酚法

1）葡萄糖标准液的配制

准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。

2）试剂

1）浓硫酸：分析纯，95.5%

2）80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3）6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4）15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

5）5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6）6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

7）6mol/L盐酸

表1 标准曲线的制作步骤

管号 0 1 2 3 4 5 6 7

葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

苯酚液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1mL15%TCA（三氯醋酸）溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

1.2.7不同菌株产酒精能力（酒精度）测试

快速氧化法

乙醇在酸性条件下,经过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋酸。再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。由反应过程中，通过消耗的硫代硫酸钠的量计算酒精含量。

试剂：重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液

方法：在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。接好装置，迅速加热至沸，并继续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。在接受瓶中，加入300ml水、10ml 碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。通过如下公式计算酒精含量。

酒精（%，V/V）=(20.00-0.6575V)/Vs

式中V——硫代硫酸钠标准溶液滴定量

Vs——试样取样量

方法二：2.2 蒸馏—密度瓶法

2.2.1 仪器

全玻璃蒸馏器（500mL）、恒温水浴（精度±0.1℃）、容量瓶（100mL）、移液管（100 ml）分析天平（感量0.1mg）、天平（感量0.1g）、25 ml附温度计密度瓶

2.2.2 操作方法

用100mL容量瓶准确量取试样100ml，置于蒸馏瓶中，用50ml水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加玻璃珠数粒，装上蛇型冷凝管，用原100ml容量瓶接收馏出液(外加冰浴),缓缓加热蒸馏，收集约96ml馏出液(蒸馏应在30-60分钟内完成)，取下容量瓶，调温到20℃，补水定容，混匀。用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20℃的相对密度，根据相对密度查表，得到试样馏出液的酒精度（%，V/V），即为试样的酒精度。

2.3 蒸馏装置

2.3.2 试剂

重铬酸钾溶液、优级纯无水乙醇

2.4操作方法

2.4.1标准曲线的制备

吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。分别吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50 ml容量瓶中，各加15.0 ml重铬酸钾溶液，加水至刻度，混匀。此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白标准作参比，在波长610nm，用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。用吸光度对酒精浓度作图，绘标准曲线。

2.4.2试样的测定

在500ml蒸馏烧瓶中，加入100.0ml试样。按1.2方法进行蒸馏，最后加适量水将蒸馏液补足为100.0ml。吸取1.0ml蒸馏液于50 ml容量瓶中，按标准曲线的制备的操作测定其吸光度，由标准曲线查出酒精含量（%、V/V）。

1.2.8α-氨基氮含量的测定

水合茚三酮是一种氧化剂，可使氨基酸脱羧氧化，而本身被还原成还原型水合茚三酮。还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应，生成蓝紫色缩合物，颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比，可在570nm下比色测定。

(1)样品稀释适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL（麦汁一般稀释100倍，啤酒50倍，啤酒应先除气）。

(2)测定取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液，另3支各吸入2mL试样稀释液，剩下3支吸入2mL蒸馏水。然后各加显色剂1 mL，盖玻塞，摇匀，在沸水浴中加热l 6分钟。取出，在20℃冷水中冷却20分钟，分别加5mL碘酸钾稀释液，摇匀。在30分钟内，以水样管为空白，在570nm波长下测各管的光密度。

计算：

α–氨基氮含量（μg/mL）=（样品管平均O.D./标准管平均O.D.）×2×稀释倍数

说明：式中

(样品管平均O.D./标准管平均O.D.）：表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比；2：标准管的α–氨基氮浓度（μg/mL），即（0.1072×14/75）×100；

方法二：α-氨基氮的测定（茚三酮法）

1、实验试剂

a显色剂

100克磷酸氢二钠（Na

2HPO

4

.12H

2

O）

60克磷酸二氢钾（KH

2PO

4

）

5.00克水合茚三酮

3.00克果糖

用水溶液溶解后稀释至1升（此溶液在低温下用棕色瓶可保存2周，pH应为6.6-6.8。操作时可以按比例配成100ml）。

b稀释溶液：2克碘酸钾溶于600ml水中，再加入96%乙醇400ml.

c标准溶液：溶107.2mg甘氨酸于100ml水中，0℃贮藏。用时按要求稀释。该溶液含有200mgα-氨基氮/升。

2、实验操作

取糖化的麦芽汁1.00ml（或者是其他的合适量，使稀释后的浓度为1-3mgα-氨基氮/升），放入100ml的容量瓶中，稀释到刻度，摇匀。

标准甘氨酸溶液稀释液：取1.00ml标准溶液，在100ml的容量瓶中稀释到刻度。

取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液（三个）稀释液各2.00ml，放入比色管中，（水用于空白对照），各比色管中分别加入1.00ml的显色剂，摇匀，在沸水中加热16min。（此时应该准备20℃的水浴）

20℃水浴中冷却20min。

加入5.00ml的碘酸钾稀释溶液，摇匀，在30min内于570nm处测定吸光度值。

3、计算

游离的α-氨基氮（毫克/升麦芽汁）=2×100×样品溶液吸光度值 / 标准溶液平均吸光度

1.2.9絮凝性的测定

良好的絮凝性不仅可以减少发酵液的澄清时间，降低酵母分离的能源消耗，还可防止酵母细胞长时间悬浮于发酵液中致使细胞自溶，有损啤酒风味。

方法：取发酵度试验沉淀的酵母，经过洗涤和离心，称取1．0 g置于带刻度的锥形离心管内，使其悬浮在10 mL pH4．5的醋酸缓冲液(O.5l g硫酸钙，6．8g冰醋酸用水稀释到1 L)中，静置5min后，将此悬浮液重新连续摇动，使酵母重新全部悬浮起来，静置观察酵母凝聚沉降速度。

表2 不同菌株絮凝性的比较

菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4

本斯值(ml) 3.0 2.8 3.0 2.8 3.2

分别称取不同菌株酵母在离心管中摇匀，静置沉降时，形成一清晰界面逐渐下降。酵母在沉降时形成一清晰界面，说明该酵母是凝集性酵母，从图2可见发酵度较高的菌株凝集性能稍差(做本试验时，室温若超过20℃，这对酵母的凝集性可能稍有影响)。

1.2.10还原性糖的测定

斐林试剂比色法测定还原糖(暂时不采用)

二、材料、仪器设备及试剂

1. 分光光度计；

2.分析天平（感量1／10000）；

3.水浴锅；

4. 具塞刻度试管；

5.刻度吸管；

6.容量瓶；

7.离心机

1. 斐林试剂A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。

2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC

4H

4

O

6

.5H

2

O）与150gNaOH溶

于蒸馏水中，并定容至1升。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。3.0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。

4.0.1moL/LNaOH。

5.甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250mL60％乙醇中。

6.10％Pb（Ac）

2。7.饱和Na

2

SO

4

（20℃19.5g）。

三、实验步骤

1. 标准曲线的制：各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500rpm离心15min。取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。

2.对含蛋白质较多的样品，此间可加10％Pb(Ac)

2，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na

2

SO4除去多余的铅离

子。

3.样品测定：吸取6ml待测液，加4ml斐林试剂，其它操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量.

按下式计算还原糖的百分含量：还原糖（％）＝查得的糖毫克数×样品总体积×稀释倍数/(测定时取用体积×样品重×1000)×100

方法2：试剂与材料（暂时采用此方法）

1.斐林试剂

甲69.3 CuSO4.5H2O 1000mL 50mL/组

乙346g酒石酸钾钠+100gNaOH 1000mL 50mL/组

2、1%次甲基蓝

1g次甲基蓝+100mL水/班棕色瓶子保存

3、0.2%标准G 2gG105度烘干到恒重加水到1000mL 2000mL/班

4、碱式滴定管

5、样品溶液：待测G液

样品1：稀释20倍，1000mL/班

样品2：稀释50倍，1000mL/班 6、电炉

操作方法：1、斐林试剂标定

A取甲液5mL+乙液5mL，（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250mL三角瓶中加入10mL水，并从滴定管加入0。2%的标准G若干毫升（约23mL）。（量控制在后滴定时消耗G在0.5—1.0mL）

B电炉上加热至沸，并维持微沸2分钟，加2滴1%次甲基溶液，趁沸以每两秒1滴的速度继续为滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准G 滴定至蓝色消失，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。记录耗用的G量V

0，

必须在1min内完成。

2、定糖预备试验

同1法取斐林试剂，加10mL样品液，摇匀于电炉上加热至沸腾，保持微沸2min,加2滴1%次甲基蓝，用0.2%G滴定至蓝色消失。

记录耗用的G量为V

1

3、样品中还原糖测定

同上法吸取斐林试剂加10mL样品液（预先稀释），补加（V

0-V

1

）mL水，并从滴定管中预先加入（V

1

-1）mL0.2%G，摇匀至

电炉上加热至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基蓝，继续用G滴定至蓝色消失。记录消耗的标准G体积为V毫升。

4、体积计算

还原糖含量（以G计）（g/mL）

=（V

-V）*0.002*1/10*n

V

----斐林试剂标定值，mL

V------样品糖液测定值，mL

0.002----标准GS液浓度，g/mL

10-----样品糖液体积，mL

n-----样品稀释倍数

备注：方案中几处指标采用多种方法，就是为了提高测量数据的准确率，并且比较检测方法的容易性、工作量、试剂的种类，以确定最终的方案。