啤酒酵母选育1

啤酒酵母选育项目

紫外诱变及其突变株的性能测试

1材料与方法

1.1材料

菌种：四铃啤酒酵母

仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。

培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）

1.2试验方法

1.2.1酵母菌的活化

取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。

然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养48h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。

1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定

1.2.2.1菌悬液的制备

取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。

取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。

（此图视为参考）

1.2.3紫外线诱变试验

用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)

备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。

2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。

3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。

实验步骤：

打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。

1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28℃活化培养14h。

2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度。

3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对照。

4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。

5 30W紫外灯下30cm处照射，调整照射时间。

本次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）

6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。（选在75%-80%）。

致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数

未经紫外照射菌落数

7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，

28℃培养20h左右，计算其突变率和致死率。（上述时间等数字视为参考数值）

1.2.3.1初筛

诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

1.2.3.2复筛

供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。（麦芽汁固体培养基）

双乙酰含量测定：

初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4 株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3 和FB-E4 。结果见表1

表1 发酵液中双乙酰含量的比较

菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4

双乙酰含量 (mg/L) 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870

降低率(%) 0 42.7 24.9 37.1 29.4

（此处绘制表格样式视为参考）

双乙酰代谢的控制：

1.降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量

措施：改良酵母菌种

提高麦汁中α-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性

2加速双乙酰的还原

措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）

提高还原温度（封罐后高温还原）

限制后期酵母的出芽率（封罐）

国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求

二级啤酒：0.2mg/moL 一级啤酒：0.13mg/moL

方法：国标GB4927-2001检测

培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。

原理：双乙酰的测定方法采用比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。

1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL

2试剂和溶液

盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）