蛋白稳定性2
生物化学 第二版 3蛋白质的性质
NH2
H+
P COO- OH-
负离子
（pH>pI）
NH+3
P
COO-
H+ OH-
两性离子
（pH=pI ）
NH+3
P
COOH
正离子 （pH<pI）
蛋白质的等电点（pI）： 在某一pH值的溶液中，可以使蛋白质所带的正电荷与负电
荷恰好相等，分子总电荷为零，呈电中性。这时的pH值就是 蛋白质的等电点。
一、蛋白质的两性解离
➢蛋白质胶体溶液的稳定性：
（1）水化层 （2）同种电荷层
➢应用：蛋白质的分离----透析。
H2O H2O
H2O
+ ++
四、蛋白质的沉淀
主要原因：水化层和电荷层被破坏。
四、蛋白质的沉淀方法
1.盐析：
破坏水化层电荷层
2.有机溶剂沉淀法： 乙醇（甲醇）+ 蛋白质破坏水化层 蛋白质
3. 加热沉淀法
四、蛋白质的沉淀方法
（1）
。
（2）
如溶解度降低，粘度增加，
易发生凝集、沉淀，易被蛋白酶水解。
二、蛋白质的变性
变性的应用：
➢ 豆腐的制作； ➢ 用高温蒸煮、照射紫外线、75%酒精等方法消毒杀菌； ➢随年龄增大皮肤变粗糙、干燥； ➢白内障； ➢植物种子放久后失去发芽能力。
三、蛋白质的胶体性质
➢蛋白质分子颗粒在1～100nm之间，溶于水后形成胶体溶液。
应用--分离蛋白质 1.等电点沉淀法 等电点时，总电荷为零，没有相同电荷的排斥，易沉淀析出。
2.电泳法 ➢ 带电颗粒在电场中向电荷相反的电极方向移动； ➢ 电泳的速度主要取决于颗粒所带电荷的多少和颗粒的大小。
揭示蛋白质结构谜团：圆二色谱计算二级结构的方法与意义探析
揭示蛋白质结构谜团：圆二色谱计算二级结构的方法与意义探析蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构与功能密不可分。
蛋白质的二级结构（secondary structure）是指由α-螺旋、β-折叠等基本结构单元组成的局部结构。
准确地确定蛋白质二级结构对于理解蛋白质的功能和相互作用具有重要意义。
在蛋白质结构研究中，圆二色谱计算成为一种常用的技术，本文将详细论述圆二色谱计算二级结构的方法与意义。
一、蛋白质二级结构的重要性。
1.什么是蛋白质二级结构？。
蛋白质的二级结构是指由α-螺旋、β-折叠等基本结构单元组成的局部结构。
它是蛋白质结构中的重要组成部分，直接影响蛋白质的稳定性、功能和相互作用。
2.二级结构的意义。
蛋白质的二级结构对于研究蛋白质的功能、相互作用和结构演化具有重要意义。
通过准确地确定蛋白质的二级结构，我们可以了解蛋白质的折叠方式、稳定性以及与其他分子的相互作用。
二、圆二色谱计算二级结构的方法。
1.圆二色谱原理。
圆二色谱是一种通过测量蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收差异来获取信息的技术。
它基于圆二色效应和手性吸收现象。
蛋白质的二级结构对圆二色谱光谱具有明显的影响。
图1。
2.CDPro软件的使用。
CDPro是一款常用的蛋白质圆二色谱数据分析软件。
它通过采用不同的算法和模型，如K2D、CONTINLL等，对圆二色谱数据进行分析和解析。
CDPro提供了直观易用的界面和功能，可以帮助研究人员准确计算蛋白质的二级结构。
3.其他方法和工具。
除了CDPro软件，还有其他常用的圆二色谱计算二级结构的方法和工具。
例如，DichroWeb是一个在线平台，提供了多种分析工具和数据库，用于解析和解释圆二色谱数据。
SELCON3是一种基于统计学方法的二级结构计算工具，可用于处理大规模数据集。
三、圆二色谱计算二级结构的意义。
1.功能和结构关联。
蛋白质的二级结构与其功能之间存在密切的关联。
二级结构元素的类型和相对位置决定了蛋白质的折叠方式和稳定性，从而影响其功能。
蛋白质稳定性及相关研究方法
蛋白质稳定性及相关研究方法蛋白质是生命体中最重要的基础分子之一，它们参与了生命的方方面面，扮演着至关重要的角色。
因此，无论从科学角度还是从医学角度，研究蛋白质的结构和功能都是至关重要的。
但是，由于许多蛋白质在自然状态下非常不稳定，很容易发生降解、变性和聚集等问题，限制了研究的深入程度。
因此，蛋白质稳定性及相关研究方法成为了近年来科学家们研究的热门课题。
一、蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性是指蛋白质在存储、转运和使用过程中维持其天然构象和活性的能力。
然而，许多因素都可能影响蛋白质的稳定性，包括温度、PH值、盐浓度、氧化还原状态、界面作用和聚集等。
其中，温度是影响蛋白质稳定性的最主要因素之一。
日常生活中，许多蛋白质只能在温度较低的条件下保持活性，如酶的最适温度通常在20-40℃之间。
但有些蛋白质需要在高温或极度低温的环境下保持活性，如一些古菌和嗜极生物所表达的蛋白质，在高温或极端寒冷环境下具有较高的热稳定性和冷稳定性。
此外，蛋白质在不同的PH值和盐浓度下也可能表现出不同的稳定性。
例如，有些酶在低盐浓度下会出现聚集现象，并导致失活，而在高盐浓度下，聚集现象可能消失而活性得以维持。
类似地，某些蛋白质在不同PH值下可能会发生酸性或碱性变性，影响其稳定性和活性。
二、蛋白质稳定性的研究方法为了研究蛋白质的稳定性，科学家们提出了许多方法。
最常用的方法之一是热力学分析方法。
热力学分析方法包括热重分析、差示扫描量热法和热差分析等，可以通过测定蛋白质在不同条件下的热稳定性和热响应来评价其稳定性。
此外，蛋白质的稳定性也可以通过生物物理学、生物化学和生物学等多种方法进行研究。
例如，通过利用软X射线晶体学技术研究蛋白质的分子结构，可以了解蛋白质的构象变化机制；还可以通过核磁共振技术、分子动力学模拟等方法揭示蛋白质分子间相互作用的变化和不同结构状态下的动力学性质。
最近，一种叫做聚合酶链式反应（PCR）的技术被广泛应用于评估蛋白质的稳定性。
三种测定蛋白质热稳定性方法的比较
Copyright©博看网 . All Rights Reserved.
第４期
２５３
周翠燕ꎬ等:三种测定蛋白质热稳定性方法的比较
蛋白质在加热过程中会发生热变性解折叠ꎬ蛋
化的趋势ꎬ所以圆二色谱法也是测定蛋白质 Ｔ ｍ 值的
指在蛋白质解折叠 ５０％时对应的温度
类蛋白的 Ｔ ｍ 值整体上较为一致ꎬ 但也存在一定差
异. 而结构更复杂的蛋白ꎬ并不一定有更多个 Ｔ ｍ 值.
表 １ 蛋白质样品信息汇总
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍｐｌｅ
分子量大小 / ｋＤａ
名称
ＰＹＬ ２
ＰＹＬ １０
植 物 ＡＢＡ ( 脱 落
ＤＳＣ) 、圆 二 色 光 谱 法 ( ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍꎬ ＣＤ) 和 差
示扫 描 荧 光 法 ( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙꎬ
ＤＳＦ) 等.
差示扫描量热法的应用始于 ２０ 世纪 ６０ 年代ꎬ
是在程序控温下ꎬ通过测量输给待测物和参比物的
功率差与温度的关系ꎬ 以获得吸放热量的技术
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＺＨＯＵ Ｃｕｉ￣ｙａｎ
１ꎬ２ꎬ３ꎬ４
ꎬ ＹＵ Ｍｉｎ￣ｄａ ５ ꎬ ＬＩ Ｗｅｎ￣ｑｉ １ꎬ２ꎬ３ꎬ４
(１.Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ( Ｂｅｉｊｉｎｇ) ꎬ Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
sumo2 分子的分子量
Sumo2 分子的分子量1. Sumo2分子的概述Sumo2（Small Ubiquitin-like Modifier 2）是一种小分子蛋白质修饰物，属于泛素家族。
它是由约95个氨基酸残基组成的多肽链，具有类似于泛素的结构。
Sumo2在细胞中起着调节蛋白质功能和细胞过程的重要作用。
2. Sumo2的生物学功能Sumo2通过共价连接到其他蛋白质上，调节这些蛋白质的稳定性、位置和相互作用。
它可以影响转录、DNA修复、细胞周期和信号传导等多个细胞过程。
2.1 蛋白质稳定性调节Sumo2可以通过与特定蛋白质结合并形成共价键来调节其稳定性。
这种共价连接阻止了受修饰蛋白质被降解系统降解，从而延长了其寿命。
2.2 蛋白质位置调节Sumo2修饰还能够改变蛋白质的亚细胞定位。
通过与特定核糖核酸转录因子或染色质结合，Sumo2可以改变基因的表达模式。
2.3 蛋白质相互作用调节Sumo2修饰还能够影响蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过与特定蛋白质结合，Sumo2可以增强或抑制其与其他蛋白质的结合能力，从而调节细胞信号传导通路。
3. Sumo2分子量的计算Sumo2分子量的计算可以通过氨基酸序列中各个氨基酸残基的分子量之和来实现。
以下是Sumo2分子量计算的步骤：3.1 确定氨基酸序列首先，需要确定Sumo2的氨基酸序列。
根据已知数据，Sumo2由95个氨基酸残基组成。
3.2 查找各个氨基酸残基的分子量根据已知数据，查找每个氨基酸残基的分子量。
例如，丙氨酸（Ala）的分子量为89.09 Da。
3.3 计算各个氨基酸残基的总和将每个氨基酸残基的分子量相加，得到Sumo2的分子量。
例如，如果Sumo2的氨基酸序列中包含一个丙氨酸（Ala），那么Sumo2的分子量将为89.09 Da。
4. Sumo2分子量的实际测定除了通过计算，科学家们还可以使用实验方法来测定Sumo2的分子量。
以下是一种常用的实验方法：4.1 质谱法（Mass Spectrometry）质谱法是一种常用的测定蛋白质分子量的方法。
试述蛋白质二及结构有哪些
试述蛋白质二及结构有哪些，蛋白质α螺旋结构的特点：蛋白质2级结构有α螺旋β折叠β转角无规则卷曲。
特点:①多个肽键平面围绕螺旋中心轴，按右手螺旋旋转，每3.6个氨基酸残基为1周，螺距为0.54nm，每个氨基酸残基分子沿螺旋轴上升的高度为0.15nm②肽键平面与螺旋长轴平行，相邻两个螺旋之间氨基酸残基可形成氢键，即每个肽键中N 上的H和它后面第4个肽键中的C上的O之间形成许多氢键，是维持α螺旋稳定的主要次级键③肽键中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧，其形状大小及带电荷的多少均影响α螺旋的稳定什么是蛋白质的变形作用变性蛋白质具有哪些特点，蛋白质变性作用：在某些理化因素作用下蛋白质严格的空间结构受到破坏，引起蛋白质某些理化性质和生物学性质的改变。
蛋白质变性的本质是空间构像的破坏，涉及次级键断裂，而没有太监的断裂。
空间构想的破坏造成：1原有生物活性的丧失2疏水集团的暴露，溶解度降低3球状蛋白失去结构的对称性导致粘度增加4变形后丧失结晶能力5肽键充分暴露易被蛋白水解酶水解试述DNA双螺旋的基本内容①两条反相平行的多核苷酸连，围绕同一中心轴构成右手螺旋结构，直径2.37nm每10.5个碱基围绕一周，螺距为3.54nm。
在空间上形成大沟和小沟相间隔②糖磷酸骨架居于外侧，碱基垂直于中心轴，深入螺旋内侧：两链上的碱基互补配对以氢键维系。
A=T,C G之间形成氢键③氢键及碱基堆积力共同维系螺旋的稳定原核生物与真核生物RNA主要有几种，每种RNA 的结构特点及有何功用RNA主要有3种：rRNA,tRNA,mRNA①rRNA：与核蛋白共同构成核蛋白体或核糖体，原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的两个亚基组成。
核蛋白体是蛋白质生物合成的场所②tRNA分子量较小，含较多稀有碱基，其3’-末端为CCA-OH，二级结构多呈三叶型，三级结构一般呈倒L型。
反密码环上有反密码子，主要功能是:能识别,mRNA上的密码，运输活化了的氨基酸，参与蛋白质的生物合成③mRNA：真核mRNA在3’-末端有多核苷酸，在5’-末端有“帽”GpppmNp，与蛋白质生物合成的启动有关。
2 通过泛素蛋白酶体降解调节FOXO蛋白稳定性
通过泛素蛋白酶体降解调节FOXO蛋白稳定性摘要：叉头框O族（FOXO）蛋白是经历进化过程而保存的转录因子。
在人类中，它们属于由FOXO1,FOXO3a,FOXO4和FOXO6组成的蛋白家族。
越来越多的证据表明，FOXO蛋白通过在转录水平调控基因表达，起到抑制肿瘤的作用，如：抑制细胞周期、凋亡、DNA修复和抵抗氧化应激等。
在人类原代肿瘤和肿瘤细胞株中，包括Akt、IκB激酶（IKK）和ERK等在内的多种蛋白激酶的活化，导致FOXO蛋白磷酸化，并通过E3连接酶如SKP2、MDM2的介导而泛素化。
从而导致FOXO 蛋白被泛素蛋白酶体系统降解，从而失去或削弱了抗肿瘤功能，使细胞的转化、增值和生存更加便利。
因此，FOXO蛋白的泛素化和降解在肿瘤发生中起到关键的作用，并在癌症治疗方面表现出可利用的价值。
1.引文对于人类肿瘤谱中的大多数肿瘤而言，它们的“人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因”（PTEN）常常是突变或缺失的。
PTEN通过对抗磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的作用，其主要功能表现为脂质磷酸酶。
PTEN的缺失导致质膜中磷脂酰肌醇(3,4,5)三羟甲基氨基甲烷磷酸盐（PIP3）水平的增加，从而导致蛋白激酶B（PKB或Akt）的活化。
Akt通过对下游一系列效应蛋白（包括FOXO转录因子）的活化或去活化的作用，对细胞存活起核心作用。
越来越多证据表明，FOXO蛋白通过调节基因表达（包括凋亡、抑制细胞周期、抵抗氧化应激、DNA修复等）而表现抑制肿瘤功能。
人类肿瘤细胞中PTEN缺失导致的Akt活化或更本质上的PI3K活化，导致FOXO 蛋白的磷酸化和抑制。
Akt磷酸化还诱导细胞核通过核孔复合体输出FOXO蛋白，此过程依赖14-3-3伴侣蛋白和输出受体——染色体区域维持蛋白1（出核因子1，核输出受体1，CRM1）。
因此，由于Akt介导的磷酸化和核输出，依赖核及转录的FOXO蛋白的抑制肿瘤的功能被废除（图1）。
蛋白二聚化
蛋白二聚化1. 什么是蛋白二聚化？蛋白质是构成生物体的基本结构和功能单位，蛋白二聚化是指两个或更多蛋白质分子结合形成一个复合物的过程。
这个过程可以通过非共价键（如静电相互作用、疏水相互作用等）或共价键（如二硫键）来实现。
在细胞内，蛋白质的二聚化是调控生命活动的重要机制之一。
它可以改变蛋白质的结构、功能和亚细胞定位，进而影响信号传导、基因转录、细胞周期等生理过程。
2. 蛋白二聚化的生理意义蛋白二聚化在细胞内扮演着重要的角色，具有多种生理意义：2.1 控制蛋白结构和稳定性蛋白二聚化可以通过两个或多个蛋白质分子的结合，增加其稳定性并改变其结构。
这对于维持蛋白质的功能至关重要。
例如，一些酶的活性仅在二聚体形式下才能发挥，而且二聚化还可以调节蛋白质的活化和去活化。
2.2 调节信号转导许多细胞信号通路中，蛋白质的二聚化是重要的调节机制。
例如，配体结合到细胞膜上的受体后，会诱导受体的二聚化，并通过蛋白质-蛋白质相互作用激活下游的信号转导分子。
此外，蛋白二聚化还可以促进信号通路中的蛋白质磷酸化、寻找靶标蛋白等过程。
2.3 调控基因转录蛋白质的二聚化可以影响基因转录的活性。
例如，一些转录因子需要通过二聚化才能结合到DNA上，并激活或抑制特定基因的转录。
此外，蛋白二聚化还可以调控染色质的结构和修饰，进而影响基因转录。
2.4 调节细胞周期蛋白质二聚化在细胞周期的调节中起着重要作用。
例如，细胞分裂周期蛋白激酶（CDK）是控制细胞周期的关键调节因子，它的活性受到与其结合的调节亚基的影响。
这种调节亚基通过与CDK形成二聚体来激活或抑制CDK的活性，从而控制细胞周期的进程。
3. 蛋白二聚化的方法和技术为了研究蛋白质的二聚化过程，科学家们发展了多种方法和技术。
3.1 X射线晶体学X射线晶体学是一种常用的方法，可以解析蛋白质和蛋白质复合物的结构，包括二聚体的结构。
通过蛋白质晶体的X射线衍射图像，可以确定蛋白质分子之间的空间排列和相互作用。
新的蛋白类型-概述说明以及解释
新的蛋白类型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以按照以下方式来写：在生物学研究中，蛋白质一直是一个重要的研究对象，它们在细胞功能和生物过程中起着关键的作用。
但是，尽管已经有大量的蛋白质被发现和研究，我们对于蛋白质的了解仍然只是冰山一角。
近年来，科学家们不断发现和研究新的蛋白质类型，这为我们深入了解细胞和生物体的功能提供了新的视角。
新的蛋白质类型通常是指那些具有特殊结构和功能的蛋白质。
相比传统的蛋白质类型，新的蛋白质类型在结构上可能更加复杂并且功能更加多样。
这些新的蛋白质类型的发现与研究能够帮助我们更好地理解细胞内的各种生物过程，例如信号传导、基因表达调控等。
近年来，科学家们通过利用先进的实验技术和分析方法，不断发现新的蛋白质类型。
这些新的蛋白质类型不仅使研究者对蛋白质的功能和结构有了更深入的认识，还为药物研发和疾病治疗提供了新的靶点和策略。
本文将首先介绍两种新的蛋白质类型，并对其结构和功能进行详细的描述和分析。
同时，本文还将总结新蛋白质类型的特点，并展望它们在未来的应用前景。
通过对新的蛋白质类型的研究，我们可以更好地了解细胞和生物体的功能机制，这对于促进生物医学研究和药物开发具有重要的意义。
1.2文章结构文章结构部分的内容应该包括对整篇文章的组成部分进行描述和概括，以及每个部分所包含的主要内容。
可以按照以下方式编写文章结构部分的内容：文章结构本文将按照以下结构进行叙述和分析。
引言：在引言部分，我们将首先对新的蛋白类型进行概述，介绍其背景和重要性。
随后，我们将阐明文章的结构和目的，以使读者对整篇文章有一个清晰的了解。
正文：正文部分将包括两个主要部分，分别介绍新的蛋白类型1和新的蛋白类型2。
对于每种蛋白类型，我们将重点探讨其特点、结构、功能以及相关的研究进展。
通过对这两种新的蛋白类型的详细介绍和分析，我们旨在提供对其在生物学和医学领域中的潜在应用的全面认识。
结论：在结论部分，我们将对新蛋白类型的特点进行总结，并对其在未来的应用前景进行展望。
可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)产品技术要求ldm
可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）测定试剂盒（磁微粒化学发光法）组成：试剂盒由试剂1、试剂2、磁分离试剂、校准品和质控品组成。
试剂1（R1）：含有异硫氰酸荧光素（FITC）标记的ST2抗体（浓度1µg/mL）、牛血清白蛋白和叠氮钠的三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。
试剂2（R2）：含有碱性磷酸（ALP）标记的抗ST2抗体（浓度1µg/mL）、牛血清白蛋白和叠氮钠的三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。
磁分离试剂（M）：含包被有抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体的磁性微粒（浓度1.0mg/mL）、牛血清白蛋白和叠氮钠的三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。
校准品（STD）：含一定浓度ST2抗原和牛血清白蛋白的缓冲液配制而成。
校准品的目标浓度分别为0.00ng/mL，5.00ng/mL，20.00ng/mL，50.00ng/mL，150.00ng/mL和300.00ng/mL。
质控品（QC）：含一定浓度ST2抗原和牛血清白蛋白的缓冲液配制而成。
质控品的目标浓度为30.00ng/mL和150.00ng/mL。
校准品及质控品浓度具有批特异性，具体浓度见瓶标签。
适用范围：该产品用于体外定量测定人血清样本中可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）的含量。
2.1 外观2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；2.1.2 磁分离试剂摇匀后为均匀悬浊液，无明显凝集；2.1.3 液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；2.1.4包装标签应清晰，易识别。
2.2线性在(1.00-300.00)ng/mL的测量范围内，试剂盒的相关系数（r）应≥0.9900。
2.3空白限应不大于1.00ng/mL。
2.4准确度回收率应在85.0%-115.0%范围内。
2.5重复性批内变异系数（CV）应不大于10.0%。
2.6批间差批间变异系数（CV）应不大于15.0%。
2.7质控品的赋值有效性质控品的测量值应在质控范围内。
蛋白质2
（3） Temperature
0－40 ℃蛋白质的溶 解度随温度的提高而 提高。 温度超过40℃时，由 于热动能的增加导致 蛋白质结构的展开 （变性），蛋白质内 部的疏水基团暴露， 促进蛋白质聚集和沉 淀。
PDI和NSI已被确定为美国油脂化学家协会的法定方法
2.4 影响蛋白质溶解性的因素
（2）盐浓度
“盐溶”（salted in）：中性盐的离子在 0.1-1Ｍ能提高蛋白质的溶解度。 增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质 分子与水分子的作用。 “盐析” （salted out）中性盐的离子 大于１Ｍ，蛋白质的溶解度降低，并可能 导致蛋白质沉淀。 高浓度盐离子可夺取蛋白质分子的水化层， 使蛋白质失水，聚合沉淀。
3.3.2、化学因素
1.pH
蛋白质所处介质的pH 对变性过程有很大的 影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低， 在中性pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电 荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。
酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶 液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离 程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子 空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间 因静电作用形成的键。
Several environmental factors, such as pH, ionic strength, type of salts, temperature, and protein conformation, influence the water binding capacity of proteins.
各种蛋白质的水合能力
a f c 0.4 f p 0.2 f N
a: g water/ g protein fC: charged residues in the protein fP: polar residues in the protein fN: nonpolar residues in the protein
secretogranin 2基因名称
Secretogranin 2基因简介Secretogranin 2（SCG2）是人类基因组中的一个基因，编码一种蛋白质，属于分泌颗粒蛋白家族。
SCG2在神经内分泌系统中起着重要的调节作用，参与了多种生理过程和疾病的发展。
基本信息•基因名称：Secretogranin 2•基因别名：SCG2, SgII, Chromogranin C•基因位置：人类染色体20q12-q13.1结构与功能Secretogranin 2编码的蛋白质是一种分泌颗粒蛋白，在细胞内被包装进分泌颗粒中，并参与细胞外分泌。
该蛋白质主要存在于神经内分泌细胞和肿瘤细胞中。
Secretogranin 2在细胞内定位于分泌颗粒的核心区域，并与其他蛋白质相互作用，调节分泌过程。
它可以与其他成员共同组成复合物，例如Chromogranin A和Secretoneurin。
此外，Secretogranin 2还具有调节钙离子浓度和神经递质释放的功能。
它能够结合钙离子，并通过与其他蛋白质相互作用，参与神经内分泌细胞中的钙离子信号传导。
生理功能Secretogranin 2在神经内分泌系统中发挥着重要的生理功能，包括以下几个方面：调节激素分泌Secretogranin 2参与调节多种激素的合成和分泌，包括胰岛素、肾上腺素、去甲肾上腺素等。
它通过与其他蛋白质相互作用，调控激素的合成和储存，以及其在细胞内和细胞外的释放过程。
调节神经递质释放Secretogranin 2在神经元中发挥着重要的调节作用，参与神经递质的合成和释放。
它能够与其他蛋白质形成复合物，在突触前区域促进神经递质的包装和运输，并影响突触传递过程。
参与细胞凋亡调控Secretogranin 2在细胞凋亡过程中扮演了关键角色。
它能够调节细胞凋亡相关蛋白的表达和活性，影响细胞的生存和死亡决策。
研究表明，Secretogranin 2的缺失或异常表达与某些肿瘤类型的发生和发展有关。
其他生理功能除了上述功能外，Secretogranin 2还参与了一系列其他生理过程，如细胞增殖、细胞迁移、血管生成等。
实验4 蛋白质理化性能2
蛋白质理化性质一．氨基酸的性质(1)酸碱性质和等电点(2)光学活性和光谱性质(3)重要化学反应与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）：•用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。
与茚三酮反应:用于氨基酸定量测定成肽反应：氨基酸合成肽的反应基础二，氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）pH< pI净电荷为正pH = pI净电荷=0pH > pI净电荷为负当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。
甘氨酸盐酸盐（A+）等电点甘氨酸（A甘氨酸钠（A-）甘氨酸滴定曲线谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算三．氨基酸光学活性和光谱性质1、旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。
2、紫外吸收光谱：参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸max）分别为280、275和257nm。
由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。
四，芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Try,W）摩尔吸收系数TryTyrPhe的紫外吸收光谱波长氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）2，4-二硝基氟苯( DNFB)（dinitrofiuorobenzene）氨基酸+ HF(2，4-二硝基苯氨基酸）氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）+异硫氰酸苯酯 (PITC)五，氨基酸与茚三酮反应（定量）△弱酸还原性茚三酮茚三酮(无色)茚三酮还原性茚三酮幻灯片12多肽N、C-末端氨基酸的测定N端 Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（苯异硫氰酸脂反应）氨肽酶法C端肼解法还原法羧肽酶法幻灯片13蛋白质顺序测定基本方法路线幻灯片14二硫键的断裂幻灯片15蛋白质一级结构测定基本策略：氨基酸顺序直测法＋片段重叠法基本步骤：(1)测定蛋白质分子中多肽链数目；(2)拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；(3)分析每一条多肽链的氨基酸组成；(4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基；(5)裂解多肽链成较小的片段；(6)测定各肽段的氨基酸顺序；(7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；(8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
蛋白质稳定性和构象的研究
蛋白质稳定性和构象的研究蛋白质是生物体中最为重要的大分子化合物之一，也是细胞生命活动中不可或缺的组成部分。
蛋白质的结构和功能是紧密联系的，蛋白质的错构造成的变化将会使功能失调，甚至导致生命活动的破坏。
因此，研究蛋白质的结构和稳定性是极为重要的。
蛋白质稳定性的研究蛋白质稳定性是指蛋白质在自然环境中能够保持足够的空间和原始结构，维持其生物学功能的能力。
蛋白质的稳定性与其氨基酸序列、化学性质、物理性质和环境因素等都有着密切的联系。
目前，有很多方法可以研究蛋白质的稳定性，如荧光谱、圆二色谱、分子动力学模拟等等。
荧光谱是一种常用的分析蛋白质稳定性的方法。
它利用蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）的荧光发射特性来评估蛋白质的稳定性。
荧光强度和波长的变化可以揭示蛋白质的结构、稳定性和折叠状态的变化。
荧光谱可以在各种状态下进行，如在高温、高压力、酸碱环境和离子强度变化等情况下的测定。
圆二色谱是分析蛋白质稳定性的另一种方法。
它利用紫外线光谱的圆二色效应来分析蛋白质的结构和构象。
圆二色谱可以区分正常的折叠状态和非正常的股票状态，并且可以探究这些状态的变化和影响因素。
此外，分子动力学模拟是一种基于计算机仿真的蛋白质研究方法，通过计算机模拟蛋白质在特定条件下的行为来探究其性质和结构。
分子动力学模拟可以模拟细胞环境中蛋白质作用的动力学，并可用于预测蛋白质的结合位点和折叠情况的变化，以及蛋白质结构重构的中间状态。
蛋白质构象的研究蛋白质的结构和构象是决定其生物学功能的重要因素之一。
蛋白质结构的决定因素包括氨基酸序列和具体构象。
蛋白质的构象在空间上的变化对其功能起着决定性的作用。
目前，有很多方法可以研究蛋白质的构象，如X射线晶体学、核磁共振技术、质谱分析等等。
X射线晶体学是一种常用的分析蛋白质结构的方法。
通过将已经结晶的蛋白质置于X射线下，并在反射的X光束上捕获衍射图像。
衍射图像的图案可以被计算机处理并解析出原子级别的结构，揭示蛋白质的结构和构象。
蛋白质的性质实验(二)
蛋白质的性质实验(二)蛋白质的性质实验(二)蛋白质的性质实验（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定1．目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
2．原理蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3．器材4．试剂（1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
5．操作（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
蛋白质的性质实验(二)（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性1．目的（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
kn基序和锚蛋白重复结构域蛋白2
kn基序和锚蛋白重复结构域蛋白2KN基序和锚蛋白重复结构域蛋白2一、引言KN基序和锚蛋白重复结构域蛋白2，简称KRIT1，是一种与遗传性血管病相关的蛋白，也是一种重要的蛋白结构域。
本文将深入探讨KRIT1的结构特点、功能及其与遗传性血管病的关联，帮助大家更全面地了解这一主题。
二、KRIT1的结构特点1. KRIT1的结构组成KRIT1蛋白是一种大约736氨基酸长的蛋白，主要由多个重复结构域组成。
其中最重要的结构域是锚蛋白重复结构域，该结构域在蛋白的稳定性和功能中起着关键作用。
2. KN基序的特点除了锚蛋白重复结构域，KRIT1蛋白中还包含了KN基序，这是一种在细胞信号传导中具有重要功能的结构域。
KN基序的存在使得KRIT1蛋白能够与其他蛋白相互作用，参与细胞生长、增殖和凋亡等生物学过程。
三、KRIT1的功能1. 与细胞连接相关的功能KRIT1蛋白的重复结构域使得它能够与细胞骨架蛋白进行结合，从而参与细胞间的连接和交流。
这种功能对于维持血管内皮细胞的结构完整性和功能活性至关重要。
2. 对血管形成的调控研究表明，KRIT1蛋白在血管形成和维持血管稳态中发挥着重要作用。
其与其他蛋白的相互作用可以影响细胞的增殖、迁移和黏附，从而调控血管新生和血管网的形成。
四、KRIT1与遗传性血管病的关联1. 遗传性出血性脑血管畸形（Hemorrhagic Cerebral Vascular Malformation，HCM）HCM是一种常见的遗传性血管病，常常是由多种基因突变所导致的。
而KRIT1基因的突变是HCM病例中最常见的原因之一，这表明KRIT1对于维持血管功能和结构的重要性。
2. KRIT1的突变与血管病理的关联许多研究发现，KRIT1基因的突变会导致其蛋白产物结构或功能发生改变，这往往会引发血管内皮细胞的异常增殖和凋亡，最终导致血管畸形的形成。
通过对KRIT1的进一步研究，或许能够为HCM的治疗和预防提供新的思路和方法。
蛋白形成二聚体的原因
蛋白形成二聚体的原因
蛋白形成二聚体是指两个相同或不同的蛋白分子在化学反应中形成一个物质结构，这
种结构可以使蛋白分子在细胞内发挥特定功能。
二聚体可以形成各种类型的蛋白质，包括酶、细胞内受体和结构性受体等。
1. 协同作用
许多酶需要两个或更多的亚基才能发挥作用，这称为协同作用。
相同或不同类型的亚
基可以形成二聚体，其中每个亚基可以在相应的位置进行反应，并协同执行特定的生物化
学反应。
2. 功能互补
不同的蛋白质可以通过形成二聚体来协同发挥作用。
例如，许多细胞内受体需要与配
体结合才能触发细胞内的信号传导，这种结合还可以通过形成二聚体来增强信号传导。
3. 稳定性
形成二聚体可以增加蛋白质的稳定性。
二聚体的结构可能比单个蛋白分子更稳定，因
为它可以协同作用，并通过组合增加结构的刚度。
由于二聚体更稳定，因此它们可以更好
地维持内部结构和可持续性。
4. 适应性
许多蛋白质分子需要通过拟合来与配体形成稳定的复合物。
形成二聚体可以增加蛋白
质与配体形成复合物的可能性。
这种适应性可以通过不同部位的互补来实现。
此外，二聚
体还可以通过将不同的蛋白质连接起来形成复杂的超分子结构，从而实现更多的适应性。
总之，蛋白形成二聚体的原因主要是为了实现协同作用、功能互补、稳定性和适应性，并提高蛋白质的活性和可持续性。
这种结构对于许多生命过程来说是至关重要的。
E.coli中蛋白稳定性的“N端法则”
蛋白质在大肠杆菌中表达出来以后，第一步是切掉N端的甲硫氨酸（Met），这一步酶解反应由methionyl aminopeptidase这个酶完成。
当+2位置（假设Met是+1位置）的氨基酸拥有一个大的侧链时，该酶解反应就会比较慢进行。
(Hirel et al.,1989;Lathrop et al.,1992)
当蛋白质N端的甲硫氨酸保持完整的时候，它在E.coli细胞中会比较稳定。
Tobias et al.(1991) 经过一系列试验发现了蛋白质细菌中保持稳定的“N端法则”。
即：
当蛋白质N端为Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr 这几种氨基酸时，该蛋白质在细菌细胞中的“半衰期”一般小于2分钟；当蛋白质N端为其余别的氨基酸时，该蛋白质在细菌体内的“半衰期”一般大于10个小时。
根据以上的规律，可以得出以下结论：要在E.coli中克隆表达一个蛋白，需要检查其+2位置氨基酸是何种氨基酸（+1位置的Met迟早会被切掉，这个时候+2位置就比较关键了），如果是Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr 这几种氨基酸中的一种，就应该将其替换掉。
不过，如果我们表达带有纯化标签的融合蛋白时，如果标签在N端就不必考虑这个问题了，而如果标签在C端，就需要注意一下这个“N端法则”了。
蛋白二聚化
蛋白二聚化一、概述蛋白二聚化是指两个蛋白质分子通过非共价作用结合成一个复合物的过程。
这种现象在生物体内广泛存在，可以发挥多种功能，如调节酶活性、激活信号通路、维持细胞结构等。
因此，研究蛋白二聚化对于深入理解生命活动具有重要意义。
二、分类根据结合方式，蛋白二聚化可分为同源和异源两种。
1. 同源二聚化同源二聚化是指两个相同的蛋白质分子通过相互作用形成复合物。
这种现象在许多酶中都有发现，如乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶等。
同源二聚化可以增加催化效率、提高稳定性等。
2. 异源二聚化异源二聚化是指两个不同的蛋白质分子通过相互作用形成复合物。
这种现象在信号转导、免疫应答等过程中都有发现。
例如，T细胞受体与MHC分子的结合就是一种异源二聚化。
三、驱动力和作用方式蛋白二聚化的驱动力主要有两种：亲和力和构象变化。
1. 亲和力蛋白质分子之间通过静电相互吸引、疏水相互排斥等力学作用形成复合物。
这种驱动力被称为亲和力。
亲和力强的蛋白质复合物比较稳定，可以长时间存在。
2. 构象变化蛋白质分子在结合前后可能会发生构象变化，这种驱动力被称为构象变化。
例如，许多受体在结合配体后会发生构象变化，从而激活下游信号通路。
四、影响因素蛋白二聚化的形成受到多种因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。
此外，蛋白质的结构也会影响其二聚化能力。
一些具有特殊结构域的蛋白质能够通过这些域与其他蛋白质相互作用，形成复合物。
五、应用前景研究蛋白二聚化对于药物设计、疾病治疗等方面具有重要意义。
许多药物的作用机制涉及到蛋白二聚化，因此深入理解蛋白二聚化对于药物研究具有重要意义。
此外，一些疾病的发生与蛋白质的二聚化失调有关，如肿瘤、神经系统疾病等。
因此，研究蛋白二聚化对于治疗这些疾病具有潜在价值。
六、结论蛋白二聚化是一种广泛存在于生物体内的现象，能够发挥多种功能。
其驱动力主要包括亲和力和构象变化。
影响因素包括温度、pH值、离子浓度等。
未来，深入理解蛋白二聚化对于药物设计和治疗某些疾病具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
a
当a=0.1(热和剪切失活速率比释放速率低10倍)时，最 少有29%和23%的活性不能回收。在破碎过程加入保护剂 就十分必要。
干燥过程的失活
• 在干燥状态蛋白质比在溶液中稳定。
• 喷雾干燥：热失活为一级反应动力学。活性损失与水 含量及温度有关。
-ln(Kr)
6
8
10
2.5 2.6 1/T=103(1/K)
化学因素
• 氢键干扰：脲，盐酸胍，甲醛干扰天然态蛋白质分
子内外维系结构和构象的氢键的形成。乙酰氨，烷脲具 有强的形成氢键能力，使肽链疏水化，破坏天然态结构 和构象。是强变性剂。
• 氧化剂：氨基酸侧链氧化，特别是功能基团氧化。敏
感氨基酸有SH、S-S、吲哚环等。
• 中性盐：低浓度下，蛋白质必需的金属离子盐有稳定
赤鲜糖醇，山梨醇，海藻糖等有稳定作用。高浓度有变性作用。
稳定化策略和方法
• 化学修饰：亲水性大分子，如多羟基化合物 • 蛋白质工程：
点突变：氨基酸替代，稳定二级和三基结构。 天然态固定：枯草杆菌蛋白酶：用可形成S-S键的半胱氨 酸代替Ser87和Thr22或Ser24，热稳定性增加。 增加内部疏水性：用疏水氨基酸替代亲水氨基酸，保持构 型和活性，增加稳定性。 减少对氧化作用敏感的氨基酸：用Ser,Ala,Leu,取代 Met222,使稳定化，如枯草杆菌蛋白酶。
失活机理
• 失活包括两个步骤： N D
I
天然态N：肽连正确折叠，紧密，球或棒状 分子，
自由能最低(40-120kj/mol)。
过度态D：构象变化，包括若干中间态，可逆，部分
或大部失活。
失活态 I ：完全变性，无序结构，不可逆，自由能最
高(＞400kl/mol)。包括共价键变化、SH氧 化、SS键还原、磷酸化、脱氨。
稳定化策略和方法
盐，低浓度(＜0.1M)和高浓度(＞0.1M)的效应不 同。
低浓度(金属离子)：活性必需金属离子，使酶分子肽链多点交联， 使结构稳定化。专一性。 α-淀粉酶：Ca2+ ,Sr2+不能代替Ca2+；碱性磷酸酯酶：Zn2+； 溶菌酶：Mn2+; 丙酮酸激酶：Mg2+；精氨酸酶：Mn2+和Cd2+ 高浓度：金属离子Ca2+ 使酶变性，沉淀。 (NH2)4SO4既是稳定剂又是沉淀剂。 淀粉酶，蛋白酶：硫代多羧酸盐；木瓜蛋白酶：硼酸盐；前 列腺酸磷酸酯酶：氟化物；磷酸果糖激酶：氰化钾；
1.降低对氧化作用敏感的氨基酸 2.低温和适中的pH 3.抑制次级反应 蛋白质工程 操作条件 添加剂
稳定化策略和方法
• 稳定酶的筛选：不同生物来源的同功酶具有不同 的稳定性，通过筛选可得稳定性好的酶。高温菌， 极端、特殊环境微生物产生的蛋白质产品。 • 添加剂 1.天然态的稳定化：根据非共价相互作用：底物， 产物，抑制剂，别构效应物其他低分子量配基。 金属离子和离子型物质（低浓度）；蛋白质，聚 合物 。
稳定化策略和方法
• 在蛋白质变性过程中，蛋白质分子的 松展常常是变性失活过程的第一步， 也是限速步骤。因此，蛋白质的稳定 化的方法是抑制或消除蛋白质分子的 松展。以后的变性步骤也重要，通过 强化结构稳定因子可以达到目的。
稳定化策略和方法
了解酶失活机理和稳定因素是选择分离纯化技 术和稳定化策略的基础 策略 方法 • 稳定天然态
稳定化策略和方法
• 多羟基醇：1-30%的乙二醇，甘油，蔗糖，葡萄糖，乳糖， • 聚合物：蛋白质，多糖，PEG等。 • 杂质：阻止次级反应
混合物 稳定作用 巯基混合物： 谷胱甘肽，半胱氨酸 抗辐射和过氧化物 β-巯基乙醇，二硫苏糖醇 抗巯基氧化 VE和Vc 抗氧化 奎宁硫酸酯 修饰 蛋白酶抑制剂：苯甲磺酰氟 专一蛋白酶 某些氨基酸 溶菌酶抗超声波
失活。冷冻失水，使结构发生变化。
• pH：pH变化引起蛋白质分子的电荷和共价键变化，使肽链松散，
引起变性和失活。 在酸性条件下，有的蛋白质稳定，有的极为敏感。组氨酸和 天冬酰氨易脱氨。 在碱性条件下，有的稳定，有的不稳定。SH和S-S活泼，易 发生β-消除作用。
• 机械力：高压，超声，剪切力，表面张力。
酶结构和稳定性
• 疏水作用，酶分子内部的疏水作用对天然态形 成有重要作用 • 氨基酸侧链，易氧化的色氨酸和半胱氨酸， • 低分子量配基，底物，活化剂，抑制剂，辅酶， 金属离子有利于稳定天然态 • 蛋白-蛋白，蛋白-脂的接触可防治疏水表面基 团与溶剂接触，提高稳定性。或防止不利的接 触，如固定化，改变微环境。
失活机理
• 天然态在一定程度上仅是热力学稳定，低 自由能使其倾向于不稳定，环境的微小变 化也会引起负自由能变化。自由能仅决定 平衡时的天然态和可逆变性态的比例，不 能说明达到平衡的速度。 • 达到平衡时的速度是由变性和复性的自由 活化能决定。变性活化能不同于天然态和 活化态的自由能；复性活化能不同于活化 态和变性态的自由能。
失活机理
失活机理
1. 凝聚(有时伴随S-S键形成）
变性条件
热，盐酸胍，脲，SDS， 震荡
2. 一级结构改变 H+和OH-催化肽键水解，酶水解， 极端pH，热，蛋白酶 自水解 功能基团氧化（SH,吲哚环） 氧化(特别是加热)和它 的代谢物 S-S键还原，分子内SH与S-S交换 热，高pH，硫醇，二 硫化物 分子内S-S键再交换 高pH，加热
作用，重金属离子，Hg，Cd和Pb与蛋白质结合或与蛋 白所需金属离子竞争抑制生物活性或造成失活；高浓度 下，可使蛋白质沉淀。与离子有关，与电荷类型无关。 硫酸铵、磷酸钾用于沉淀和稳定天然态；KCl和NaCl作 用小。
化学因素
• 与水混溶的有机溶剂： 一元醇和其他溶剂，因疏水作用常引起稳定性降低。 二元醇，取决于其疏水性大小。 三碳或多碳的多元醇，有增加天然态稳定性的作用。 • 表面活性剂：低浓度下，因与蛋白质有强的相互作 用，引起变性。离子型比非离子型变性作用更强。 • 螯合剂：像EDTA, 1.10-二氮杂啡能结合配基或金属 离子，使含有金属离子的蛋白质失活。
细胞破碎过程的失活
• 机械破碎细胞过程为一级反应动力学，蛋白质 失活的主要机理是： • 热失活：一级反应。
Ca(t)
a=0
a=0.5 a=2 时间
细胞破碎过程的失活
• 剪切失活：
Ca(t) a=0
a=0.5
a=1 a=2 时间
细胞破碎过程的失活
• 热失活与剪切失活对细胞破碎过程蛋白质活性的影 响源自蛋白质在后处理过程中的失活
• 后处理过程的基本单元操作：
分离：固-液分离，细胞破碎，细胞破碎物的去除。絮 凝，离心，过滤，膜分离（微滤）。除细胞破 碎外，其他主要问题是流失。 浓缩：沉淀，膜分离（超滤，微滤），透析。 纯化：色谱(离交，亲和，疏水，吸附，凝胶)，结晶 制剂：干燥(冷干，热干)，混合，制粒，粉碎
生物因素
• 蛋白酶水解： 水解速度取决于蛋白质的构型，大小， 电荷和结构性质。酸性和较大的蛋白质 比中性或碱性和较小的蛋白质降解的快。 • 抑制剂：
酶结构和稳定性
通过点突变，蛋白质工程，化学修饰等 手段研究酶的结构与稳定性关系及影响酶稳 定性的因素：
• • • • • 静电相互作用：盐桥(内部20kj/mol,外部4-10kJ.mol) 偶极-偶极和色散相互作用：数量大，作用明显 氢键：支持二级结构 二硫键：固定天然态，S-S键提供15-20kJ/mol 致密包装：内疏水，外亲水，水化壳，25%空隙
稳定化策略和方法
2.依据专一作用和改变溶剂系统性质：离子型物 质（高浓度），有机溶剂和聚合物。高浓度盐， 一些有机溶剂（适中浓度）和聚合物可稳定蛋 白质。 • 阻止次级失活作用：加入适当的保护剂
稳定化策略和方法
底物、辅酶和小配基有稳定作用
酶
乳酸脱氢酶
稳定剂和方法
底物，NAD，NADH，乳酸，效应 物如3-乙酰基吡啶-NADH和果糖二 磷酸 丙酮酸使之不稳定 β-葡糖苷酶 葡萄糖和果糖，麦芽糖无效 酵母t-RNA和核苷酸转移酶 底物，ATP和CTP 葡萄糖淀粉酶 底物类，葡萄糖，δ-葡萄糖内酯和 乳糖（乳糖由于溶剂效应而起到稳 定作用）
1.加入必需金属离子，底物，抑制剂，辅酶等 添加剂 2.改变酶表面附近水活性（蛋白质的优先水化） 添加剂 3.引入二硫键加固活性构型 蛋白质工程 4.减少疏水表面基团 蛋白质工程 5.增加内部疏水作用 蛋白质工程 6.氨基酸残基紧密装配 蛋白质工程
稳定化策略和方法
策 略 方 法
• 抑制次级‘不可逆’反应
失活机理
失活机理
重要SH修饰
变性条件
金属离子，二 硫化物 蛋白质磷酸化 蛋白质激酶 催化活性中间物引起的‘自杀失活’ 底物 氨基酸消旋 加热，高pH 次级序列形成的S-S键断裂 加热，高pH Asn脱氨 加热，高pH
失活机理
失活机理
3. 辅酶从活性中心上解离 4. 寡聚蛋白解离成亚基 5. 蛋白质吸附容器表面 6.‘不可逆’构型变化 7. 液流的剪切失活
2.7
干燥过程的失活
• 喷雾干燥：干燥过程：
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 T A W
0
2
4 时间
6
8
干燥过程的失活
• 冷冻干燥：
缓冲系统的pH变化： 升温速度和时间 真空度与水的升华速度 保护剂的溶解度
谢谢！
分离纯化过程中蛋白质的 稳定性
孙万儒
中国科学院微生物研究所
蛋白质的结构
蛋白质的稳定性
• 蛋白质的稳定性主要是指保持其生物活性 的能力。与蛋白质结构，构象有关。 • 关系到分离纯化的活性收率，生产成本。 • 关系到蛋白质制剂能否应用和商品化。 • 在分离纯化过程中关注的是： 那些因素影响蛋白质稳定性。 如何减少活性损失，保持稳定
变性条件