蛋白稳定性2

稳定化策略和方法
• 多羟基醇：1-30%的乙二醇，甘油，蔗糖，葡萄糖，乳糖， • 聚合物：蛋白质，多糖，PEG等。 • 杂质：阻止次级反应
混合物 稳定作用 巯基混合物： 谷胱甘肽，半胱氨酸 抗辐射和过氧化物 β-巯基乙醇，二硫苏糖醇 抗巯基氧化 VE和Vc 抗氧化 奎宁硫酸酯 修饰 蛋白酶抑制剂：苯甲磺酰氟 专一蛋白酶 某些氨基酸 溶菌酶抗超声波
蛋白质在后处理过程中的失活
• 后处理过程的基本单元操作：
分离：固-液分离，细胞破碎，细胞破碎物的去除。絮 凝，离心，过滤，膜分离（微滤）。除细胞破 碎外，其他主要问题是流失。 浓缩：沉淀，膜分离（超滤，微滤），透析。 纯化：色谱(离交，亲和，疏水，吸附，凝胶)，结晶 制剂：干燥(冷干，热干)，混合，制粒，粉碎
2.7
干燥过程的失活
• 喷雾干燥：干燥过程：
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 T A W
0
2
4 时间
6
8
干燥过程的失活
• 冷冻干燥：
缓冲系统的pH变化： 升温速度和时间 真空度与水的升华速度 保护剂的溶解度
谢谢！
失活机理
失活机理
1. 凝聚(有时伴随S-S键形成）
变性条件
热，盐酸胍，脲，SDS， 震荡
2. 一级结构改变 H+和OH-催化肽键水解，酶水解， 极端pH，热，蛋白酶 自水解 功能基团氧化（SH,吲哚环） 氧化(特别是加热)和它 的代谢物 S-S键还原，分子内SH与S-S交换 热，高pH，硫醇，二 硫化物 分子内S-S键再交换 高pH，加热
变性条件
螯合剂，硫醇，透析，金属离子， 加热 化学修饰，极端pH，脲，表面 活性剂，高或低温 小蛋白浓缩，加热 加热，极端pH，有机溶剂，盐 酸胍 流体力学
物理因子
• 热：在Tm以上，变性自由能成负值，有助于变性。 热使蛋白质
的肽链松散，低温下这种变化是可逆的，超过Tm，结构变 化不可逆。
• 冷：大多数蛋白质在0-4℃最稳定，但在低温冷冻和融化时会发生
1.降低对氧化作用敏感的氨基酸 2.低温和适中的pH 3.抑制次级反应 蛋白质工程 操作条件 添加剂
稳定化策略和方法
• 稳定酶的筛选：不同生物来源的同功酶具有不同 的稳定性，通过筛选可得稳定性好的酶。高温菌， 极端、特殊环境微生物产生的蛋白质产品。 • 添加剂 1.天然态的稳定化：根据非共价相互作用：底物， 产物，抑制剂，别构效应物其他低分子量配基。 金属离子和离子型物质（低浓度）；蛋白质，聚 合物 。
1.加入必需金属离子，底物，抑制剂，辅酶等 添加剂 2.改变酶表面附近水活性（蛋白质的优先水化） 添加剂 3.引入二硫键加固活性构型 蛋白质工程 4.减少疏水表面基团 蛋白质工程 5.增加内部疏水作用 蛋白质工程 6.氨基酸残基紧密装配 蛋白质工程
稳定化策略和方法
策 略 方 法
• 抑制次级‘不可逆’反应
失活。冷冻失水，使结构发生变化。
• pH：pH变化引起蛋白质分子的电荷和共价键变化，使肽链松散，
引起变性和失活。 在酸性条件下，有的蛋白质稳定，有的极为敏感。组氨酸和 天冬酰氨易脱氨。 在碱性条件下，有的稳定，有的不稳定。SH和S-S活泼，易 发生β-消除作用。
• 机械力：Байду номын сангаас压，超声，剪切力，表面张力。
作用，重金属离子，Hg，Cd和Pb与蛋白质结合或与蛋 白所需金属离子竞争抑制生物活性或造成失活；高浓度 下，可使蛋白质沉淀。与离子有关，与电荷类型无关。 硫酸铵、磷酸钾用于沉淀和稳定天然态；KCl和NaCl作 用小。
化学因素
• 与水混溶的有机溶剂： 一元醇和其他溶剂，因疏水作用常引起稳定性降低。 二元醇，取决于其疏水性大小。 三碳或多碳的多元醇，有增加天然态稳定性的作用。 • 表面活性剂：低浓度下，因与蛋白质有强的相互作 用，引起变性。离子型比非离子型变性作用更强。 • 螯合剂：像EDTA, 1.10-二氮杂啡能结合配基或金属 离子，使含有金属离子的蛋白质失活。
生物因素
• 蛋白酶水解： 水解速度取决于蛋白质的构型，大小， 电荷和结构性质。酸性和较大的蛋白质 比中性或碱性和较小的蛋白质降解的快。 • 抑制剂：
酶结构和稳定性
通过点突变，蛋白质工程，化学修饰等 手段研究酶的结构与稳定性关系及影响酶稳 定性的因素：
• • • • • 静电相互作用：盐桥(内部20kj/mol,外部4-10kJ.mol) 偶极-偶极和色散相互作用：数量大，作用明显 氢键：支持二级结构 二硫键：固定天然态，S-S键提供15-20kJ/mol 致密包装：内疏水，外亲水，水化壳，25%空隙
失活机理
失活机理
重要SH修饰
变性条件
金属离子，二 硫化物 蛋白质磷酸化 蛋白质激酶 催化活性中间物引起的‘自杀失活’ 底物 氨基酸消旋 加热，高pH 次级序列形成的S-S键断裂 加热，高pH Asn脱氨 加热，高pH
失活机理
失活机理
3. 辅酶从活性中心上解离 4. 寡聚蛋白解离成亚基 5. 蛋白质吸附容器表面 6.‘不可逆’构型变化 7. 液流的剪切失活
失活机理
• 失活包括两个步骤： N D
I
天然态N：肽连正确折叠，紧密，球或棒状 分子，
自由能最低(40-120kj/mol)。
过度态D：构象变化，包括若干中间态，可逆，部分
或大部失活。
失活态 I ：完全变性，无序结构，不可逆，自由能最
高(＞400kl/mol)。包括共价键变化、SH氧 化、SS键还原、磷酸化、脱氨。
化学因素
• 氢键干扰：脲，盐酸胍，甲醛干扰天然态蛋白质分
子内外维系结构和构象的氢键的形成。乙酰氨，烷脲具 有强的形成氢键能力，使肽链疏水化，破坏天然态结构 和构象。是强变性剂。
• 氧化剂：氨基酸侧链氧化，特别是功能基团氧化。敏
感氨基酸有SH、S-S、吲哚环等。
• 中性盐：低浓度下，蛋白质必需的金属离子盐有稳定
细胞破碎过程的失活
• 机械破碎细胞过程为一级反应动力学，蛋白质 失活的主要机理是： • 热失活：一级反应。
Ca(t)
a=0
a=0.5 a=2 时间
细胞破碎过程的失活
• 剪切失活：
Ca(t) a=0
a=0.5
a=1 a=2 时间
细胞破碎过程的失活
• 热失活与剪切失活对细胞破碎过程蛋白质活性的影 响
Ca(t) 剪切 热
a
当a=0.1(热和剪切失活速率比释放速率低10倍)时，最 少有29%和23%的活性不能回收。在破碎过程加入保护剂 就十分必要。
干燥过程的失活
• 在干燥状态蛋白质比在溶液中稳定。
• 喷雾干燥：热失活为一级反应动力学。活性损失与水 含量及温度有关。
-ln(Kr)
6
8
10
2.5 2.6 1/T=103(1/K)
酶结构和稳定性
• 疏水作用，酶分子内部的疏水作用对天然态形 成有重要作用 • 氨基酸侧链，易氧化的色氨酸和半胱氨酸， • 低分子量配基，底物，活化剂，抑制剂，辅酶， 金属离子有利于稳定天然态 • 蛋白-蛋白，蛋白-脂的接触可防治疏水表面基 团与溶剂接触，提高稳定性。或防止不利的接 触，如固定化，改变微环境。
稳定化策略和方法
2.依据专一作用和改变溶剂系统性质：离子型物 质（高浓度），有机溶剂和聚合物。高浓度盐， 一些有机溶剂（适中浓度）和聚合物可稳定蛋 白质。 • 阻止次级失活作用：加入适当的保护剂
稳定化策略和方法
底物、辅酶和小配基有稳定作用
酶
乳酸脱氢酶
稳定剂和方法
底物，NAD，NADH，乳酸，效应 物如3-乙酰基吡啶-NADH和果糖二 磷酸 丙酮酸使之不稳定 β-葡糖苷酶 葡萄糖和果糖，麦芽糖无效 酵母t-RNA和核苷酸转移酶 底物，ATP和CTP 葡萄糖淀粉酶 底物类，葡萄糖，δ-葡萄糖内酯和 乳糖（乳糖由于溶剂效应而起到稳 定作用）
稳定化策略和方法
盐，低浓度(＜0.1M)和高浓度(＞0.1M)的效应不 同。
低浓度(金属离子)：活性必需金属离子，使酶分子肽链多点交联， 使结构稳定化。专一性。 α-淀粉酶：Ca2+ ,Sr2+不能代替Ca2+；碱性磷酸酯酶：Zn2+； 溶菌酶：Mn2+; 丙酮酸激酶：Mg2+；精氨酸酶：Mn2+和Cd2+ 高浓度：金属离子Ca2+ 使酶变性，沉淀。 (NH2)4SO4既是稳定剂又是沉淀剂。 淀粉酶，蛋白酶：硫代多羧酸盐；木瓜蛋白酶：硼酸盐；前 列腺酸磷酸酯酶：氟化物；磷酸果糖激酶：氰化钾；
失活机理
• 天然态在一定程度上仅是热力学稳定，低 自由能使其倾向于不稳定，环境的微小变 化也会引起负自由能变化。自由能仅决定 平衡时的天然态和可逆变性态的比例，不 能说明达到平衡的速度。 • 达到平衡时的速度是由变性和复性的自由 活化能决定。变性活化能不同于天然态和 活化态的自由能；复性活化能不同于活化 态和变性态的自由能。
稳定化策略和方法
• 在蛋白质变性过程中，蛋白质分子的 松展常常是变性失活过程的第一步， 也是限速步骤。因此，蛋白质的稳定 化的方法是抑制或消除蛋白质分子的 松展。以后的变性步骤也重要，通过 强化结构稳定因子可以达到目的。
稳定化策略和方法
了解酶失活机理和稳定因素是选择分离纯化技 术和稳定化策略的基础 策略 方法 • 稳定天然态
赤鲜糖醇，山梨醇，海藻糖等有稳定作用。高浓度有变性作用。
稳定化策略和方法
• 化学修饰：亲水性大分子，如多羟基化合物 • 蛋白质工程：
点突变：氨基酸替代，稳定二级和三基结构。 天然态固定：枯草杆菌蛋白酶：用可形成S-S键的半胱氨 酸代替Ser87和Thr22或Ser24，热稳定性增加。 增加内部疏水性：用疏水氨基酸替代亲水氨基酸，保持构 型和活性，增加稳定性。 减少对氧化作用敏感的氨基酸：用Ser,Ala,Leu,取代 Met222,使稳定化，如枯草杆菌蛋白酶。
分离纯化过程中蛋白质的 稳定性
孙万儒
中国科学院微生物研究所
蛋白质的结构
蛋白质的稳定性
• 蛋白质的稳定性主要是指保持其生物活性 的能力。与蛋白质结构，构象有关。 • 关系到分离纯化的活性收率，生产成本。 • 关系到蛋白质制剂能否应用和商品化。 • 在分离纯化过程中关注的是： 那些因素影响蛋白质稳定性。 如何减少活性损失，保持稳定