pcr检测技术

《食品安全学》综述

PCR快速检测技术综述

1．前言

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。

2.研究的目的与意义

聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定

量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。

3.国内外研究现状

3.1. 基础研究方面的应用

目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：

[1] 扩增目的基因和鉴定重组子；

[2]克隆基因；

[3]基因功能和表达调控的研究；

[4]基因组测序；

[5]制备单链模板；

[6]致突变；

3.2. PCR在临床上的应用[2]

[1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。

[2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

[3]在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。

3．3. 在法医学中的应用[3]

例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。

所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将4.相关检测技术

4.1.技术原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温下也能发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

4.2.工作原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR

扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

4.3.工作步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA