脑科学研究的方法

4、原位杂交法
核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列 片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表 达。
基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配 对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或 DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞 内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过 标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或 DNA的存在与定位。
5、受体定位法：研究受体在神经系统内的定位
配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的 配体和受体结合以示踪其部位 免疫组织化学法：用针对受体的抗体
6、神经系功能活动形态定位法
脱氧葡萄糖法： 原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量
代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区别地将 2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是己糖激酶的 底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被 磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖-6-PO4，不能继续 在糖酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经 元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。
除了基因研究外，还有抗衰老制剂的研究。褪黑素与微量元素是被 认为有抗衰老作用的物质。褪黑素的自由基清除能力在众多自由基 清除剂中表现特别突出，而微量元素摄入不协调，将导致衰老。
还有一种说法，节食能够延长寿命。这背后的生物学原理是：生长 激素和胰岛素信号途径在起作用。科学家通过对猴子、酵母菌、果 蝇等动物的研究中验证了减少卡路里摄入能够延长寿命的理论。
第一章
神经科学
脑科学研究的方法和手段
多学科综合
神经解剖学
神经生理学
神经生物化学 心理学
………..
多层次的研究
认知 神经科学
分子 神经科学
细胞 神经科学
计算 神经科学
神经科学
发生 神经科学
临床 神经科学
系统和行为 神经科学
wk.baidu.com
研究水平
整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听
觉，痛觉等
细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、
对于长寿基因及衰老基因的发掘，也有不赞同的声音。他们认为这 违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化的要领“生存和繁 殖”，也会越来越少的被考虑，我们将剥夺后代的生存机会。
技术的进步带来的潜在社会问题，还有待进一步去解决。就目前的 研究状况来看，长寿不意味着不会永生，科学的帮助下，人们有机 会将有限的生命拉长，将有限的生命过得更有质量，实现不老不病 的愿望。
此时又想到了Venter先生，据悉，Venter曾作为美国海军医疗队的 医院参加越战，战场的残酷使他认识到生命和时间的宝贵，他认为 人生的每一分钟都应该有所创新。撇开进化的需要不谈，试想有一 天，我们不再会变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生 即知将死的时候那样，珍惜生命中的每一天，而努力奋斗呢。
3、荧光组织化学法
用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。
基本过程有：固定、制片、反应等三步。
免疫组织化学反应：有直接法和间 接法
双重免疫组织化学染色：主要是 为了研究两种物质在同一细胞或突起内 的共存现象，或含两种不同化学物质的 相互关系。
免疫组化
根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、 胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、 免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术
变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断 后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反应， 来研究纤维的联系。
*物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、 超声破坏等。
*化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅 高蕈氨酸）、单胺类神经毒（６－羟多巴胺、 ６－羟多巴、双羟色胺）
神经元质膜荧光染料法：
用羰花青（carbocynine）荧光染料，可 以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定 的标本上追踪纤维联系。
最新研究进展： 华人学者绘制小鼠大脑神经网络图
不同的大脑区域必须相互沟通才能控制复杂的思想和行 为，但目前对于这些区域组织成为广阔神经元网络的机 制却相对知之甚少。2014年2月27日《细胞》（Cell） 杂志上的一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员 采用神经元示踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示 了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见的 荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质的不同区域，这些小 分子沿着“细胞高速公路”运输，标记了大约600个神 经元通路。研究人员采用高分辨率显微镜扫描了这些大 脑区域，构建出了皮质连接的图像数据库。
【为什么我们会追求不老和长寿】
对于不老和长寿的探索，恐怕是除了“我们是谁”“ 我们从哪儿来”之外，人们思考的第三个问题了——“ 我们能否一直存在下去”。
【对衰老和长寿的基因研究】
有一个规律，很多问题，如果解释不了，就说它是由 于基因决定的，多半错不到哪里去。也因此，生物学 家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合， 从基因的角度开始对长寿和衰老问题的探索。
通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测
分子水平的实验：离子通道、受体、酶、
遗传物质等
一、形态学方法 二、生理学方法 三、电生理学方法 四、生物化学方法 五、分子生物学方法 六、脑成像（Brain imaging）技术
一、形态学方法
常规染色和特殊染色 束（通）路追踪法 荧光组织化学法 原位杂交法 受体定位法 神经系功能活动形态定位法
尼氏染色
多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇， 天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺 染料均可以使尼氏体着色
2、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系
束路追踪
原理：轴浆运输 示踪物质：HRP，荧光染料，
各种标记物标记的葡萄糖，放射 性核素标记的氨基酸等。
观察：根据示踪物质不同，采用
目前基因方面的研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里 说的并不是单一的基因，而是与长寿和衰老有关的多种基因，它们 之间的相互作用带来了不老和长寿的结果。衰老的表现为染色体端 粒长度的改变、DNA损伤、甲基化等，衰老的终点就是死亡，这些 因素也是影响长寿的原因。
有科学家认为，端粒（细胞核两端的特殊DNA片段）长度决定生物 的寿命，端粒的缩短会导致细胞分裂的停止和死亡的来临。发现端 粒的三位科学家获得了2009年诺贝尔生理学或医学奖。
细胞色素氧化酶法：
神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供 神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平 与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺 激的结果。
二、生理学方法
损毁法 刺激法 周身给药法 脑室注射法 脑组织培养 亚细胞分析 神经递质释放量的测定 神经递质的功能测定 行为学方法 最常用的有两种：神经行为学、电生理学
目前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者认为 ，消除自由基的某些酶类基因、与细胞生长调控有关的某些基因与 长寿和衰老相关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发现更 多的相关基因，理清那些导致衰老、影响长寿的基因群及其之间的 联系，才能在理解基因组的基础上，解决衰老、长寿的问题。
【其他长寿和抗衰老的办法】
组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细 胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体 基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研 究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定 位与表达。
核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫 细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能 的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究 的重要手段。
此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三 种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA， 制成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切 酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA 探针(cDNA)；③依照待测核酸的核苷酸序列，应用 DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。
cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射 性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。
当研究人员分析这些连接时，他们发现大脑皮质是一个 高度组织化的网络，由八个子网络构成，它们协调活动 反映动物的情感和感觉。并且，子网络之间以一种非常 特殊的方式来共享这一信息。“这些研究发现挑战了流 行假说：大脑皮质是一个单一的网络，在这一网络中所 有一切都密集连接在一起。”
接下来，研究人员可将来自这一重要哺乳动物模型系统 的解剖数据与大量现有的分子遗传数据合并来鉴别神经 细胞基本类型。“确定全脑的结构组织将是朝着揭示脑 功能以及在神经系统疾病中功能障碍的结构基础迈出的 基本且令人兴奋的一步，”董宏伟说。
我们真的会永远不老吗？——从“科 学狂人”的抗衰老研究说起
John Craig Venter的身上从不缺乏话题。从单枪匹马 与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基 因组计划代表Francis Collins同时选为封面人物，到 宣布制造出首个能够自我复制的活细胞“Synthia”， 轰动了整个学术界，Venter的每一个举动，在学术界 都会引起波澜。前阵子，他又宣称将组建新公司HLI ，组建史上最大的基因组数据库，结合基因组学、生 物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长 人类寿命。
抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽
。 抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放
硼硅玻璃与r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri- etriethoxysilane） 反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。 该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方 式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针
组织显色、荧光显微镜或放射自 显影等方法。
轴浆运输法—利用神经元轴浆运输现象的追踪法.
追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradish peroxoidase, HRP)、荧光染料包括核黄(nuclear yellow)、固蓝 (fast blue)及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽 凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)和菜豆凝集素 (phaseolus vulgaris agglutinin)、细菌毒素如霍乱 毒素、病毒如活的神经病毒 (胞疹病毒和弹状病毒）
另一些科学家提出引起机体衰老和疾病的是自由基的增多，这也是 现实生活中那些宣称“清除自由基，恢复年轻态”的保健品所依赖 的理论基础。这些保健品疗效有限，请不要轻易尝试。
除了遗传因素之外，人生活的环境、人的心理状况等多方面因素都 会影响到寿命。保持愉悦的心情，健康的生活方式，良好的饮食习 惯，这样即使躯体不可避免的老化，但还是有年轻的心态，总好过 长寿但不快乐，年轻的外表下，却住着一个老灵魂。
c-fos(Fos)法：
c-fos是一种原癌基因，属于即刻－早期基因类 (immediate-early gene).很多刺激条件可通过第二信 使引起神经元c-fos的表达增加，形成fos mRNA。由 fos mRNA翻译成的Fos蛋白，立即转位至细胞核内， 与另一即刻早基因c-jun 所产生的蛋白Jun构成二聚 体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列 的细胞反应。
1.常用普通染色方法
TTC染色 HE 锇酸染色 氯化金浸染 Cajal银浸染色 尼氏染色
HE（苏木素－伊红）
锇酸染色
锇酸染色是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本 来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以 用于有髓神经纤维的染色
氯化金浸染
氯化金浸染
Ach荧光染色
运动终板
Cajal银浸染色
1、神经递质释放量的测定（在体in vivo和 离体in vitro)
推挽灌流法：
在体研究中枢核团递质释放的有用方法。 通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织， 从流出液中分析神经递质的变化。
脑透析术(brain dialysis)：
在特定的脑区内，植入透析探头，用生理 溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度 递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌 流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变 化过程。脑透析术的装置包括探头、导管、微 量灌流泵、样品收集器和定量分析仪。