甲胎蛋白基因的检测

检测肝癌细胞的扩散水平，辅助影像学和病理学检
查。
参考文献

[1]NIEChang-fu,WANGJian-Guo,YANGRui-min.The Detection of AFP mRNA expression in PeriPheral Blood of Patients with Hepotocellular Careinomal Using Real Time RT-PCR Method. Chinese Journal of Misdiagnosties, November2013,Vol.3 No.11




RNA提取

12.将提取的RNA于紫外分光光度计上定量测OD
值定量RNA浓度 注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之 间（组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量； 组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染）

13.于0.8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。
cDNA合成

cDNA合成使用Promega逆转录试剂盒 反应管中加入1ug总RNA和0.5ug oligodT,70℃预变性5min, 迅速置冰上冷却


加入5×RTbuffer[250mM Tris-HCL(PH8.3),375mM
KCl,15mM MgCl2,50mM DTT]4ul,10mM dNT1ul,RNA酶 抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加0.1%DEPC水至总体积 20ul,37℃水浴60min
甲胎蛋白基因的检测
outline
实验
目的
方法
可能 设计
路线 的结
与原
理
果分
析
应用
实验目的

目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据
mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP （甲胎蛋白）基因的表达进行检测。

取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌
性肝病患者作为对照组。
实验方法及原理

通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成 cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰 度。
50ul PCR反应体系中,包括5×PCR buffer 10ul,AFP 上下游引物各16pmol,荧光探针10pmol,Tag酶 3U,10mM dNTP1ul,cDNA 5ul

在ABIPRISM7700型PCR仪(美国PE公司)进行扩增。 反应条件:93℃预变性2min,93℃45s,55℃120s,共 40个循环。反应结束后由计算机自动得出每ug总RNA 中AFP mRNA的拷贝数。
1.细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min， 使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保 持。 2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。 3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混 匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器， 以免基因组DNA断裂。



4.4℃12,000rpm离心15min。 5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万 不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质， 则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则 弃下层酚相。
实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR） 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合 酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号， 对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内 参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量 分析。
RNA提取

6.按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀， 室温放置5-10min。 7.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8.按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温 和振荡离心管，悬浮沉淀。 9.4℃ 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥5-10min。RNA样品不 要过于干燥，否则很难溶解。 11.可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶 解RNA样品，55-60℃,5-10min。
技术路线
琼脂糖凝胶
电泳
提取RNA
cDNA合成
统计学处理
qPCR检测
RNA提取

用TRIzol试剂盒提取RNA
TRIzol是一种新型总RNA抽提试 剂，可以直接从细胞或组织中提 取总RNA。其含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞并
抑制细胞释放出的核酸酶。
RNA提取

带手套是必须的， 手是RNase的主要 来源！
统计学处理

统计学处理进行t检验,以p<0.05为显著统计学 差异。
可能的结果分析

肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表
达水平有显著差异。
应用

AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落
入血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏 癌组织直接释放少量裸露的AFPmRNA,也会被血 液中丰富的RNA酶所迅速降解,外周血中检出 AFPmRNA即提示血循环中存在活动的肝癌细胞。

95℃3min灭活逆转录酶,-20℃冻存备用。
RT-PCR

上游引物序列:
5’--TGGGACCCGAACTTTCCAAG--3’

下游引物序列:
5‘--CCTGCAGACAATCCAGCACAT--3’

探针序列：
5’--TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT--3’
RT-PCR
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