薄层板的制备、活度检测及应用

验一薄层板的制备、活度检测及应用
一、实验目的与要求
1．掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法。

2．掌握吸附剂活度测定的原理及方法。

3．应用薄层层析法检识中草药化学成分。

4. 了解薄层色谱的原理及应用范围。

二、实验原理
薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。

把欲分离的样品点在薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的展开剂中, 在密闭的层析缸中展开，使混合物得以分离的方法。

由于层析在薄层上进行故而得名。

薄层层析是一种微量、快速的层析方法。

它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定，还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。

薄层层析根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素、硅胶、硅藻土)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。

薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶（氧化铝的活化温度为150℃－160℃，硅胶的活化温度为105℃－110℃）。

吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。

分配薄层层析在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。

薄层层析选择展开剂视被分离物的极性及支持剂的性质而定。

如果薄层层析所用的支持剂是吸附剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附性质有如下规律：1.饱和碳氢化合物不易被吸附；2.不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈紧密；3.当碳氢化合物被一个功能基取代后，吸附性增大。

吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶剂才能推动它。

选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。

极性大的化合物需用极性大的展开剂，极性小的化合物需用极性小的展开剂。

一般情况下，先选用单一展开剂如苯、氯仿、乙醇等，如发现样品个组分的R f值较大，可改用或加入适量极性小的展开剂如石油醚等。

反之，若样品的个R f值较小，则可加入适量极性较大的展开剂展开，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行展层。

在实际工作中，常用二种或三种溶剂的混合物作展开剂，这样更有利于调配展开剂的极性，改善分离效果。

通常希望R f值在0.2-0.8范围内，最理想的R f值是0.4-0.5之间。

溶剂极性大小的次序是：石油醚 < 二硫化碳 < 四氯化碳 < 三氯乙烯 < 苯 < 二氯甲烷 < 氯仿 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 乙酸甲酯 < 丙酮 < 正丙醇 < 甲醇 < 水。

三、时间安排
四、实验材料、试剂与仪器
1. 仪器与设备
载玻片、玻璃片、毛细管、层析缸、滴瓶、喷雾瓶、电吹风、喷雾器、烘箱、干燥器、直尺。

2. 材料
芦丁标准品、槐米的黄酮提取物等。

3. 药品
硅胶G、羧甲基纤维素钠、展开剂、显色剂等。

五、实验方法与步骤
1.薄层板的制备
（1）硅胶（G）薄层板的制备
【调浆】取硅胶G或硅胶GF（吸附剂）1份，置烧杯中加水约5份混合成均匀的膏状.
【涂布】用药匙取一定量，分别倒在一定大小、洁净、干燥的玻璃板上（或倒入涂布器中，调节涂布器的高度，推动涂布），均匀涂布成0.25-0.5 mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀。

【干燥】室温下在水平位置放置，待薄层发白近干。

【活化】将凉干的薄层板置于烘箱中105℃活化0.5-1 h，冷后贮于干燥器内备用。

活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。

本实验采用下述简易操作涂布薄层：取表面光滑，直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.3-1 mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套
上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将吸附剂均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。

铺板的加水量及活化时间
取羧甲基纤维素（粘结剂）0.2 g，溶于25 ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶（颗粒度10-40 μm的约6-8 g）混合成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8 %（羧甲基纤维钠1 0 ml，倒入广口瓶（高约10-12 cm）中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3 g，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然
阴干，105 ℃下活化30 min。

冷后置于干燥器内备用。

未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。

2. 吸附剂硅胶的活度测定
一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。

欧洲药典1969年记载用0.01 %二甲基黄（Dimethy-yellow. p-Dimethylaminoazobenzene）、苏丹红（Sudan Ⅲ）、靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10 μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10 cm（约20 min），三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线，二甲基黄斑点在薄层的当中，苏丹红斑点在靛酚蓝与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。

青岛海洋化工厂出售的薄层层析用硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G（G是Gypsum石膏的缩写，表示加了石膏）、硅胶H（H表示不加石膏）、硅胶GF254（F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰）、硅胶GF365（表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉）。

3. 薄层层析的应用
薄层层析法在天然药物化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。

用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。

由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。

薄层层析的操作步骤：
【点样】（1）样品的溶解：将样品溶于展开剂极性相近、挥发
性高的有机溶剂。

（2）薄层点样：用毛细管（0.5mm以下）或用专业点样器进行点样。

点样的要求：样点位置应在距离底边1.5-2 cm处；点样量适当；样点直径小于2-3 mm；干后间隔反复点样；多个样点时，间隔为2 cm且处于同一条直线上。

经验做法：可先在TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。

【展开】在层析缸中加入扩展剂1cm厚，加盖平衡0.5 h。

当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层板点样端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。

盖好层析缸盖，上行展层。

当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干。

要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。

【显色】如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。

如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显
色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色或者用适当的显色剂处理来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。

【比移值的计算与定性、定量】展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。

比移值的符号为R f：
注意事项：薄层层析的R f值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。

因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。

例1：槐米中黄酮成分的TLC检识
吸附剂：硅胶CMC-Na薄层板
样品：槐米中总黄酮溶液
展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）
显色剂：1 %三氯化铝乙醇溶液
例2：湖北贝母生物碱成分的TLC检识
吸附剂：硅胶CMC-Na薄层板
样品：湖北贝母总生物碱氯仿溶液
展开剂：C6H5-EtoAc-NHEt2（6：4：1）
显色剂：改良碘化铋钾喷雾
例3：丹参色素的TLC检识
吸附剂：硅胶G-CMC-Na薄层板
样品：丹参乙醚提取液
展开剂：石油醚-醋酸乙酯（9：1）
检测：紫外灯下检测
记录TLC结果
六、注意事项
1. 薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。

2. 薄层板需放在105-115 ℃的烘箱内活化30 min，取出后在干燥器中冷却备用。

3. 样点位置应在距离底边1.5-2 cm处,样品原点直径应小于0.5 cm，相邻两斑点中心间距应大于1.5 cm。

4. 先用展开剂蒸汽饱和、再入液展开；样点不能泡在展开剂中；薄层浸入时不能歪斜进入。

5. 当展开剂前沿上升到离薄层板上端2-3 cm处时，停止展开。

七、思考题
1. 吸附层折的基本原理是什么？
2. 薄层层析板为何要进行“活化”？
3. 薄层板的涂布要求是什么？为什么要这样做？
4. 点样的要求是什么？为什么要这样做？
5. 展开前层析缸内空间为什么要用溶剂蒸汽预先进行饱和？
6. 在一定的操作条件下为什么可利用R f值来鉴定化合物？
7. 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？
8. 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？。