血凝和血凝抑制

+
9
、、
10
、、
11(+)
12（-)
8
25 25 25 25
++++
弃
x 25血 凝素 25 25
++++ 11(+)
H A
25 25 25 25
-
25 25 25 25
-
25 x 25 25
_ 12（-)
孔号
稀释度
PBS
1
2 25 25
2 3
4 25 25 8 25 25
4
16 25 25
5
32 25 25
血凝抑制试验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上， 在第1排1-10孔内加入25ul PBS缓冲液，第11孔不加。 第12孔加25ul PBS缓冲液。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入 第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡后，室 温静止作用40min。 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震荡， 室温30min。 5.观测结果，记录实验数据．
血凝和血凝抑制试验
一、试验目的
１血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)， 采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。 ２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒． ３检测鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状态。 掌握血凝和血凝抑制试验的原理和操作方法，能够 正确判定试验结果
实验材料
器材：96孔V型微量反应板、微量移液器、枪头
试剂：1%鸡红细胞(采集健康鸡血液，以阿氏液抗凝，
用PBS洗涤3-5次，用PBS配成1%红细胞悬液备
用)。
试验抗原、PBS缓冲液
血凝实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ulPBS缓冲液，第11孔不加。第12孔 加25ulPBS缓冲液
25
25 ++++
2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第
2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推 至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感 作15-30min，每5min观察一次结果。 5.Leabharlann Baidu算血凝效价，稀释使成为四价备用．
二、血凝试验(hemagglutination test)
• 原理 病毒粒子上的血凝素蛋白与红细胞特定表 面受体相结合，引起特异性凝集。 ——血凝现象：有些病毒可凝集某些动物 （如鸡、鹅、豚鼠、绵羊）和人的红细胞。
HA试验的原理示意图
用途：1确定病毒的存在； 2测定病毒的血凝价 血凝价：能使一定量红细胞发生50%凝集的 病毒最高稀释度
孔号
稀释度
PBS 血凝素
PBS 1%鸡红 细胞 结果预测
1
2
25 25 25 25
++++
2 3
4
25 25 25 25
++++
4
16
25 25 25 25
++++
5
32
25 25 25 25
++++
6
64
25 25 25 25
+++
7
128
25 25 25 25
++
8
256
25 25 25 25
6
64 25 25
7
128 25 25
8
256 25 25
9
、、
10
、、
HI
弃 X 25 25 x
25 25
25 25
待检血 清
4HA血凝 素
1%鸡红 细胞 结果预测
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25 ++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 -
血凝抑制试验结果判定
• 测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+) 凝集 （-） • 病毒对照孔：凝集 • RBC对照孔：无自凝 • 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血 清稀释度。
• 思考题 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反 应？为什么？ 2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应? 为什么？ 3、血凝试验中为什么要加补充液？ 4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？ 5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集 价。