透射电子显微镜生物样品常规制样技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
由于H—7650透射电镜具有高反差功能以及配备了高灵敏度 的底插式CCD，图片反差强，因而，在切片染色时间上需要做一 个适当的调整。 对于生物样品而言，染色要根据样品的特性、观察目的以 及温度等因素，染色时间要有所不同。对于一般生物样品的观察， 染色时间为铀染10分钟，铅染5分钟；要观察植物叶绿体片层染 色时间为铀染5分钟，铅染1～3分钟。 另外，样品固定和切片时也要根据样品的不同选择适当的 固定时间和切片厚度。
取 材 方 法
因此，需要适当的抽气使材料沉入固定液中，从而达到充分固 定的目的。 （3）野外取样方法 准备好装有冰块的保温瓶，放入一定量的戊二醛固定液和缓 冲液。取材时，可先取比标准体积稍大的组织块，放入固定液内， 带到实验室后再切成标准块。
切 片 染 色
切片染色通常采用铀—铅双染色的方法。
染色时间：文献或资料上推荐一般为铀染15～30分钟；铅 染10～15分钟。
2、四氧化锇
物理特性：四氧化锇俗称锇酸，强氧化剂；带有刺激性气味的淡黄 色结晶，熔点40℃，沸点130℃，低于沸点时升华，溶于水。市售四氧
化锇一般为0.5克包装，密封于小玻璃安培瓶里，有剧毒。
制样技术中所用的化学试剂
健康危害：吸入、消化道摄入和皮肤接触毒性很强，导致严重烧伤 和刺激，蒸气、固体及溶液对皮肤具有腐蚀性，吸入会引起肺水肿。
健康危害：对眼和上呼吸道有强烈地刺激性，长时间吸入或皮肤接 触能致敏。 固定作用：醛类固定剂中的醛基对细胞结构具有很高的亲和力，能
制样技术中所用的化学试剂
较好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，对微管、内质网等细胞膜系 统和细胞基质具有良好的固定作用。
缺
点：对脂质不起固定作用。
使用浓度：浓度范围为1～6%，一般常用浓度2%～3%。通常用 pH 6.8～7.5的 0.2M 磷酸缓冲液配制。
透射电子显微镜 生物样品常规制样技术
南京农业大学生命科学 实验中心电镜室 2010.6.21
制样技术中所用的化学试剂
一、固定剂
1、戊二醛 物理特性：带有刺激性气味的无色或淡黄色液体，熔点-14℃，沸 点189℃，与水混溶。市售戊二醛一般为25％的水溶液，pH值在2～3.5 之间。 性 能：穿透性强、固定迅速、能较好地保存酶的活性。
谢谢！
须迅速。
取材的原则和基本要求
生物材料特别是动物材料在离体后，由于组织细胞中的各
种酶，尤其是溶酶体中的水解酶迅速释放到组织中，会造成蛋白
质、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。 （3）取材时的温度要低 主要是为了降低组织内酶的活性，减少蛋白质和核酸降解 的速率。 取材应在0～4℃的低温条件下操作，取材的器械和固 定液也要预冷。
忽略其组织的机能；从生物化学观点考虑，
主要研究的是组织和细胞的机能，对形态的 要求有所降低。
透射电子显微镜常规制样步骤
取材 锇酸固定 (后固定) 环氧丙烷置换 60℃）
醛类固定 (前固定) 缓冲液清洗 浸渍 修块 包埋 超薄切片
缓冲液清洗 梯度脱水 聚合（45℃、 铀染色 、铅染色
取材的原则和基本要求
取材的原则和基本要求
（4）材料的体积要小 通常戊二醛的渗透深度约为 0.5 毫米，锇酸的渗透深度约 为 0.25 毫米。由于固定液的渗透能力原因，为了使材料各部分 能够得到迅速的固定，取材的体积不应超过1立方毫米。 （5）取材时应避免损伤 取材器械要锋利，尽量减少由于挤压、牵拉所造成组织内 部结构的损伤破坏。通常使用手术刀或双面刀片。
制样技术中所用的化学试剂
二、缓冲液 磷酸缓冲液（PBS)、 二甲砷酸钠缓冲液（CAB） Biblioteka Baidu、脱水剂 乙醇、丙酮
透射电镜生物样品制备的基本要求
透射电子显微镜常规制样技术也称为超薄切片技术，它是根据透 射电子显微镜的性能以及对生物样品的要求的一种样品制备技术。 超薄切片制样技术目前还存在一定的缺 陷，制样过程中应根据研究目的的不同，对 样品制作的要求应有所侧重。从组织形态学 观点考虑，需要尽可能真实精确地保存结构,
取 材 方 法
（1）动物取材
一般将动物麻醉或急性处死后迅速解剖选取出所需要的组
织器官，放入预冷的固定液中，然后再在滴有预冷固定液的蜡板 或泡沫板上，用新的锋利的刀片切成1mm3左右的小块，用牙签 轻轻挑入到装有预冷固定液的玻璃小瓶内，置于4℃条件下低温 固定。 对于特殊材料如神经组织或脑组织，可用原位固定或灌流 固定，待组织适度硬化后再取材。
取 材 方 法
（2）植物材料 植物材料的取材较为容易，材料离体后的变化不会像动物 材料那样快。但仍需要尽快投入预冷固定液中固定。植物材料表 面的毛刺需要组织软化处理，表面有蜡质的叶片要进行脱蜡处理， 再用双蒸水清洗数次后，取材固定。 植物叶片可切成1mm宽、2～3mm长的长条状，直径小于 0.5mm的幼根可直接取2 ～3mm长一段。 由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，
（1）取材部位要准确
▲ 根据实验的目的和要求，选取特征非常明显的正常或病 变组织的部位。 ▲如果实验对象是经过一个系列方法（时间系列、浓度系 列等）处理，取材时要做到各阶段取材部位尽可能保持一致，这 样最终的实验结果才有可比性。 （2）取材要迅速 为了使生物体活体时的状态能够完整的保存下来，取材时必
固定作用：由于它与氮原子有极强的亲和力，所以能与氮基、肽、
蛋白质反应，在蛋白质之间形成交联，使其稳定，而且不会形成沉淀。 四氧化锇对脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。
缺
点：四氧化锇对 DNA、RNA、糖元和微管等没有固定作用，
而且对酶的活性影响很大，因此在细胞化学和免疫电镜实验中应避免使 用。 使用浓度：通常使用浓度为1%~2%。
取 材 方 法
因此，需要适当的抽气使材料沉入固定液中，从而达到充分固 定的目的。 （3）野外取样方法 准备好装有冰块的保温瓶，放入一定量的戊二醛固定液和缓 冲液。取材时，可先取比标准体积稍大的组织块，放入固定液内， 带到实验室后再切成标准块。
切 片 染 色
切片染色通常采用铀—铅双染色的方法。
染色时间：文献或资料上推荐一般为铀染15～30分钟；铅 染10～15分钟。
2、四氧化锇
物理特性：四氧化锇俗称锇酸，强氧化剂；带有刺激性气味的淡黄 色结晶，熔点40℃，沸点130℃，低于沸点时升华，溶于水。市售四氧
化锇一般为0.5克包装，密封于小玻璃安培瓶里，有剧毒。
制样技术中所用的化学试剂
健康危害：吸入、消化道摄入和皮肤接触毒性很强，导致严重烧伤 和刺激，蒸气、固体及溶液对皮肤具有腐蚀性，吸入会引起肺水肿。
健康危害：对眼和上呼吸道有强烈地刺激性，长时间吸入或皮肤接 触能致敏。 固定作用：醛类固定剂中的醛基对细胞结构具有很高的亲和力，能
制样技术中所用的化学试剂
较好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，对微管、内质网等细胞膜系 统和细胞基质具有良好的固定作用。
缺
点：对脂质不起固定作用。
使用浓度：浓度范围为1～6%，一般常用浓度2%～3%。通常用 pH 6.8～7.5的 0.2M 磷酸缓冲液配制。
透射电子显微镜 生物样品常规制样技术
南京农业大学生命科学 实验中心电镜室 2010.6.21
制样技术中所用的化学试剂
一、固定剂
1、戊二醛 物理特性：带有刺激性气味的无色或淡黄色液体，熔点-14℃，沸 点189℃，与水混溶。市售戊二醛一般为25％的水溶液，pH值在2～3.5 之间。 性 能：穿透性强、固定迅速、能较好地保存酶的活性。
谢谢！
须迅速。
取材的原则和基本要求
生物材料特别是动物材料在离体后，由于组织细胞中的各
种酶，尤其是溶酶体中的水解酶迅速释放到组织中，会造成蛋白
质、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。 （3）取材时的温度要低 主要是为了降低组织内酶的活性，减少蛋白质和核酸降解 的速率。 取材应在0～4℃的低温条件下操作，取材的器械和固 定液也要预冷。
忽略其组织的机能；从生物化学观点考虑，
主要研究的是组织和细胞的机能，对形态的 要求有所降低。
透射电子显微镜常规制样步骤
取材 锇酸固定 (后固定) 环氧丙烷置换 60℃）
醛类固定 (前固定) 缓冲液清洗 浸渍 修块 包埋 超薄切片
缓冲液清洗 梯度脱水 聚合（45℃、 铀染色 、铅染色
取材的原则和基本要求
取材的原则和基本要求
（4）材料的体积要小 通常戊二醛的渗透深度约为 0.5 毫米，锇酸的渗透深度约 为 0.25 毫米。由于固定液的渗透能力原因，为了使材料各部分 能够得到迅速的固定，取材的体积不应超过1立方毫米。 （5）取材时应避免损伤 取材器械要锋利，尽量减少由于挤压、牵拉所造成组织内 部结构的损伤破坏。通常使用手术刀或双面刀片。
制样技术中所用的化学试剂
二、缓冲液 磷酸缓冲液（PBS)、 二甲砷酸钠缓冲液（CAB） Biblioteka Baidu、脱水剂 乙醇、丙酮
透射电镜生物样品制备的基本要求
透射电子显微镜常规制样技术也称为超薄切片技术，它是根据透 射电子显微镜的性能以及对生物样品的要求的一种样品制备技术。 超薄切片制样技术目前还存在一定的缺 陷，制样过程中应根据研究目的的不同，对 样品制作的要求应有所侧重。从组织形态学 观点考虑，需要尽可能真实精确地保存结构,
取 材 方 法
（1）动物取材
一般将动物麻醉或急性处死后迅速解剖选取出所需要的组
织器官，放入预冷的固定液中，然后再在滴有预冷固定液的蜡板 或泡沫板上，用新的锋利的刀片切成1mm3左右的小块，用牙签 轻轻挑入到装有预冷固定液的玻璃小瓶内，置于4℃条件下低温 固定。 对于特殊材料如神经组织或脑组织，可用原位固定或灌流 固定，待组织适度硬化后再取材。
取 材 方 法
（2）植物材料 植物材料的取材较为容易，材料离体后的变化不会像动物 材料那样快。但仍需要尽快投入预冷固定液中固定。植物材料表 面的毛刺需要组织软化处理，表面有蜡质的叶片要进行脱蜡处理， 再用双蒸水清洗数次后，取材固定。 植物叶片可切成1mm宽、2～3mm长的长条状，直径小于 0.5mm的幼根可直接取2 ～3mm长一段。 由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，
（1）取材部位要准确
▲ 根据实验的目的和要求，选取特征非常明显的正常或病 变组织的部位。 ▲如果实验对象是经过一个系列方法（时间系列、浓度系 列等）处理，取材时要做到各阶段取材部位尽可能保持一致，这 样最终的实验结果才有可比性。 （2）取材要迅速 为了使生物体活体时的状态能够完整的保存下来，取材时必
固定作用：由于它与氮原子有极强的亲和力，所以能与氮基、肽、
蛋白质反应，在蛋白质之间形成交联，使其稳定，而且不会形成沉淀。 四氧化锇对脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。
缺
点：四氧化锇对 DNA、RNA、糖元和微管等没有固定作用，
而且对酶的活性影响很大，因此在细胞化学和免疫电镜实验中应避免使 用。 使用浓度：通常使用浓度为1%~2%。