动物蛋白质粗提实例

大连湾牡蛎蛋白的分离提取及分子量测定

崔韶晖，王艳颖，崔杰，王岩，左明，宁洪良

1、试剂

Tris—HCI、SDS、2-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、葡聚糖凝胶G-100 (SephadexG一100)为进口分析纯试剂；冰醋酸、NaCl、Glycine、甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、标准蛋白(Marker)、牛血清蛋白等为国产分析纯试剂．

2、仪器

FSH-2型可调高速匀浆器、TDL-40B大容量低速离心机、旋转蒸发仪(BUCHI)、紫外分光

光度仪、垂直板电泳装置(安玛西亚)、凝胶成像分析仪(Image Station 440CF，KODAK)、

脱色摇床、层析柱(1.0x30cm)等．

3、实验方法

1制备牡蛎匀浆

用自来水清洗新鲜牡蛎，除去内脏，再用去离子水冲洗干净，取5个为一组放入匀浆杯中，调速7000～10000转将牡蛎匀浆破碎成浆状组织液体．

2冰醋酸粗提牡蛎中蛋白组分

向匀浆液中滴加足量的冰醋酸，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至匀浆液不再粘稠为止，静置10min，使冰醋酸与蛋白充分反应，移人离心管中离心分离，转速4000r／rain离心20分钟，反复提取2次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩提取。

大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取

骆子生王敏彦姜玲玲

1. 1动物

健康SD大鼠,体重300 g左右，鼠龄2～3个月。由河北省实验动物中心提供。

1. 2试剂

所用试剂均为国产分析纯试剂。

1. 3主要仪器

日立80P—7超速离心机，RPS40T水平转头，日立UV330紫外—可见分光光度计。

4、过氧化物酶体的分离

①大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用冷生理盐水将血迹冲洗干净。

②称取10g肝脏，用剪子剪碎后，加50ml提取缓冲液(蔗糖0.25mol/L，乙醇0.1%，Na3EDTA 1mmol/L，Tris-HCl，pH7.4，10mmol/L)，在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。

④肝匀浆3000 r/min、离心10min，除去组织块，取上清液备用。

⑤向沉淀中加入50ml提取缓冲液再次匀浆，肝匀浆3000r/min、离心6min，弃沉淀(A)。将两次离心所得上清液合并，7000 r/min、离心5 min，取上清。13500 r/min、4℃离心20min,弃上清(B)，留沉淀。

⑥向沉淀中加入40ml缓冲液混悬后，再次13500 r/min、离心20 min，弃上清，取沉淀。用3ml缓冲液将沉淀悬浮，此为过氧化物酶体的粗提物(C)。

⑦在13ml的PA离心管中加入45.8% (w /w)的蔗糖液5ml，再缓慢加入37.4% (w /w)的蔗糖液4ml，制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约4 ml)缓慢加在梯度液上，用RPS40T水平转头，慢加速至27500 r/min、离心2 h。

⑧样品被分成肉眼可见的三层分布状态(见图1)：上边一层是微粒体，中间一层是线粒体，最底部沉淀即是过氧化物酶体。收集管底的沉淀，用13ml提取缓冲液悬浮，27500 r/min、离心2 h，洗去浓蔗糖溶液。

东亚钳蝎纤溶活性蛋白的分离纯化及其作用性质研究

黄锦兵

1、主要实验仪器

组织捣碎机：佛山市顺德区方胜电器实业有限公司

KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司

JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司

AUY220电子分析天平：梅特勒一上海

HC—TPll—5架盘药物天平：上海精科天平

KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司

DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司

TH-500梯度混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司

HL-2恒流器：上海沪西分析仪器厂有限公司

BSE-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司

UV-180紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司

XWT-S小型台式记录仪：上海自动化仪表三厂

1810B自动双重纯水蒸馏器：上海建强玻璃仪器有限公司

梅特勒一托利多SevenEasy pH计：梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司

2、主要实验试剂：

磷酸氢二钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

磷酸二氢钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

硫酸铵：分析纯，天津市福晨化学试剂厂

三(羟甲基)氨基甲烷：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

盐酸：分析纯，广州市东红化工厂

氢氧化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：分析纯，广州化学试剂厂

氯化钡：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司

聚乙二醇10000：实验试剂，天津市瑞金特化学品有限公司

氯化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

D45nm透析袋：美国进口

DEAE-32纤维素：广东省汕头市西陇化工厂进口分装(沃特曼产品)

无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司

考马斯亮蓝G-250：USB，北京鼎国生物技术有限责任公司

磷酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂

1总蛋白的提取

1溶液的配制：

①pH=7.6，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液的配制取6.053g Na2HP4·12H20，0.4863g

NaH2P04·2H20定容至1L

②pH=8.0，浓度为0.02mol/L Tris-HCl的配制取973.33μL浓盐酸，2.4228gTris定容至1L

2实验材料准备：

1．透析袋的处理：新的透析袋在使用前必须要进行前处理，具体方法如下：

⑴先把把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。

⑵在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。计算2％(w/v)的NaHCO3溶液和lmmol/L EDTA(pH8.0)的用量：若m(NaHCO3)=2g，则

V(NaHC03)=2/2％=100ml，则需NaHCO3溶液l00ml。若需EDTA溶液500ml，而m(EDTA)=1 ×l0-3mol/L×0.5L×292.25g/mol=0.1461g。即称取0.1461g的EDTA粉末，溶于水，定容至500ml即可。

(3)反复用蒸馏水冲洗透析袋的内部及外部。

(4)放在lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。

(5)冷却后，存放于4℃冰箱内，必须确保透析袋始终完全浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时总须戴手套。

(6)使用透析袋前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。

注：步骤4，用lmmol/L EDTA(pH8.0)煮沸10分钟的操作，可代之以将透析袋装于盛满水松盖瓶内，在201bf/in2(1.379×105Pa)高压下蒸汽灭菌l0分钟。

2．DEAE-32纤维素预处理：称取DEAE-32纤维素18g，采用以下方法前处理：

(1)加180mL离子水于DEAE-32纤维素中，浸泡溶胀24小时。

(2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0mol/L HCl液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时预处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。

(3)倾去凝胶上层的水及悬浮碎片后，加入凝胶等体积的1.0mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法去细颗粒。

(4)重复步骤2的操作。

(5)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的0.0lmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的Tris—HCl缓冲液，重复平衡3次。

(6)将DEAE-32纤维素凝胶溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl缓冲液的烧杯中，备用。

3、提取步骤：

1．取东亚钳蝎剪尾，分别对蝎尾和蝎身称重，高速组织捣碎机进行捣碎，加入5倍蝎尾和