3--蚕豆根尖微核实验

蚕豆根尖微核实验（诱导与检测部分）

一、实验目的

1、了解环境诱变物对微核产生的原理。

2、掌握微核试验技术。

3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义

二、实验原理

微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，可在它附近看到若干个圆形的结构，直径大约是细胞直径的1/20到1/5，这就是微核。

微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。

由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。

微核产生的概率可与诱变因子的剂量成正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。

三、实验器具、药品

1、实验材料

蚕豆种子

2、实验器材

光学显微镜、试管（10ml）、蚕豆发芽盒、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。

3、试剂

1）NaN3(叠氮钠)

2）卡诺氏固定液（乙醇和冰醋酸按照体积比3：1混合配制）

4）6mol/L盐酸：

配制：取49.5ml 37.5%的盐酸，再加入50.5ml水稀释至100ml容量瓶.

四、实验步骤

1、种子处理：

蚕豆种子洗涤干净，室温（25℃）下用蒸馏水浸泡发芽24小时，此间至少换水两次，所换水应预温至25℃。种子吸涨后，移入铺有干净纱布的托盘内，在25℃温箱中催芽培养（4-5天），当初生根长到2cm 时，选取发育良好的，大小与根长相似的幼根，进行进一步实验。 2、处理

每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。用被检测液处理根尖，用蒸馏水作阴性对照，处理根尖6～24h （处理时间可视实验需要和被测液浓度而定）。 3、根尖细胞恢复培养

将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2-3min 。将洗净的种子再放入铺好滤纸的托盘内25℃温箱中恢复培养22-24小时。 4、固定：

吸取5ml 的卡诺氏固定液于10ml 试管中，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0cm 的根尖10-20条，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24小时，固定液的用量为材料体积的15倍以上。固定后如果不及时制片，可换入70% 的乙醇中，置4℃冰箱内保存备用。 5、酸解：

取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗幼根３min ，洗净蒸馏水，加入6mol/L 盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分钟，幼根软化即可。 6、染色：

解离后材料水洗3min 并吸干，挑取1个根尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴改良苯酚品红染液，染色10～15min ，压片。 7、压片

在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。 8、镜检及微核识别标准

首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。 微核识别标准：

（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。

（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。

每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。 五、实验结果

1、实验进程记录（包括预实验）

2、计算微核率（‰）：

1000⨯=

细胞数

溶液染毒根尖观察到的微核数

溶液染毒根尖观察到的微核率

3、计算微核指数（MI ）

用微核指数作为判断实验样本是否致蚕豆根尖细胞突变的指标，以直观反映实验材料是否致突变及其严重程度。微核指数的计算公式： 阴性对照的微核率样本的微核率

）微核指数（=

MI

污染指数在0～1.5区间为基本没有污染；1.5～2区间为轻污染；2～3.5区间为中污染；

3.5以上为重污染，将样本的蚕豆根尖微核指数大于1.5 定为开始产生致突变作用。

六、实验分析

1、注意事项

固定材料如果不能及时使用：可以经过90％酒精换到70％酒精中各半小时，换入70％酒精，0-4摄氏度保存半年，再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。

化学药品处理浓度太高，会导致细胞核变形，而不是形成微核，故应该多设浓度梯度或进行预实验。

2、作业：

1）画出具有微核的细胞示意图。

2）微核率与处理药物的浓度有何关系？