电镜细胞化学技术专业知识讲座

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电镜细胞化学技术
从光镜组织化学的基础上发展起来， 任务是研究细胞内各种成分在超微结构 水平上分布情况以及这些化学成分在细 胞活动过程中的动态变化。酶的细胞化 学，免疫细胞化学，放射自显影以及各 种细胞组成的生化分析等都属于电镜细 胞化学的范围。
ß－甘油磷酸钠 PH 5.0
ROH＋H3PO4
Pb3(PO4)2
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二、氧化还原酶
包括氧化酶和脱氢酶，在氧化还原酶细 胞化学方法中，包含着两个既分开又紧 密联系的底物，在细胞化学中一个底物 被还原，另一个被氧化。两个底物中， 有一个是酶的理想底物，另一个是专门 选择的在氧化还原时会起重要化学变化 的某种物质，后一种底物有很多方面可 看作是捕捉剂的等效物，称捕捉底物。
四、置换缓冲液
将组织片放入配制孵育液用的缓冲液中， 换液2－3次，每次5－10分钟，使组织内部建 立细胞化学反应所需的PH条件，缓冲液温度 须保持4℃左右。有些细胞化学反应中有预孵 育步骤，即将组织片浸在没有底物的孵育液 里20分钟左右，在酶与底物相遇之前使组织 内部建立起所需的PH以及足够的捕捉剂的浓 度。
酸酶）
ACP酶（酸性磷酸酶）
细胞色素氧化酶，琥珀酸 脱氢酶
过氧化氢酶（H2O2酶） 核糖核苷酸酶（如ATP
酶），碱性磷酸酶
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酶细胞化学的基本原理
在生物化学中，按照催化反应的性 质将酶分成水解酶、氧化还原酶、转换 酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。 但在细胞化学上可以检出的酶多数属水 解酶和氧化还原酶两大类。
当被检查的材料被充分固定时，用冰冻切片机制 作切片能较好的保持微细结构。当材料不能充分 固定或不能被固定时，由于冷冻溶解能引起组织 结构的损伤，所以用组织切片机或振荡切片机。
对一些有方向性的组织，在切薄片前必须注意样 品的定向，事先确定所需要细胞的位置。
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氧化酶
H2O2 DAB
氧化酶 H2O
DAB氧化聚合物 OsO4 （锇酸）
锇黑（高电子密度）
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脱氢酶
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一、水解酶
酶wk.baidu.com条件
捕捉剂
底物
初级反应产物
最终反应产物
捕捉剂通常是重金属（如铅、钡、铜等）
一般来说，这些最终产物在细胞内的位置代 表酶促反应的位置，也就是酶的定位。
以酸性磷酸酶为例：
酸性
磷酸酶
Pb2+
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常用固定剂对超微结构和酶活性保存情况
保存情况
乙醛
超微结构 的情况
酶活性
差
好
丙烯醛 好—优秀 差
巴豆醛 尚可
好
甲醛 尚可 优秀
戊二醛 优秀
好
乙二醛 尚可，好 好
保存情况
羟基乙二醛
超微结构 的情况
酶活性
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酶细胞化学的意义
酶的细胞化学定位对研究细胞的生理功 能和病理过程有重要意义；
很多酶可以作为细胞膜和各种细胞器的 标志酶，而且有些细胞还有其特有的标 志酶，这就为研究细胞器的结构与功能， 细胞器的相互关系以及细胞的鉴别提供 了一种新的武器。
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三、切组织片
将长条组织块埋在7％琼脂中，用组织切 片机切成25μm－75μm的组织片，将切下的组 织片浸泡在4℃的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中； 或将组织块用冰冻切片机切成所需厚度的组织 片，但需防止冰晶的产生。也可用振荡切片机 切成45 μm左右的组织片。
以琥珀酸脱氢酶为例
琥珀酸盐
琥珀酸
延胡索酸盐 脱氢酶
高铁氰化物[Fe(CN)63¯] 亚铁氰化物[Fe(CN)64¯]
Cu2+
亚铁氰化铜
注：Cu2+存在在柠檬酸钠或酒石酸钾钠条件下
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常用的酶细胞化学试验步骤
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细当胞之处器，请联和系本它人或们网站的删除标。 志酶
细胞器 内质网 高尔基体 GERL和溶酶体 线粒体 微粒体 细胞膜（膜性结构）
标志酶
核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸 酶
TPP（硫胺素焦磷酸酶）， NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷
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酶细胞化学的发展情况
酶细胞化学是从50年代末开始发展。 酶在生命活动中占有极其重要的地位，
离开了酶，一切生命活动所需的物质代 谢将成为不可能。 目前已知有2000多种酶。
LM组织化学方法----显示出酶100多种 EM细胞化学-----显示出酶80多种 南医大电镜室----EM----显示出酶30多种
一、取材与固定
实验动物组织最好用灌注固定，人体活检 标本以浸泡固定为主。用2％戊二醛固定液经 血管灌注固定动物组织5分钟左右，然后取下 所需的组织，切成宽1mm，长5－10mm长方 形组织块，在同样的固定液中继续固定，固定 时间随组织大小、种类而定。各种酶对固定液 敏感度和耐受性也不同，必须根据具体情况选 择固定液的温度、浓度、时间和PH。
好
好
乙-甲基丙烯醛 好
好
丙酮醛
差
差
琥珀醛
尚可
好
丙醛
尚可
好
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二、漂洗组织 用0.1M二甲胂酸钠缓冲液（PH7.4） 在4℃下漂洗组织，洗去戊二醛固定液， 漂洗时间最少2小时以上，可以过夜。
二甲胂酸钠缓冲液是最理想的漂洗液，因 为它不干扰任何酶的细胞化学反应。