紫外线与硫酸二乙酯复合诱变选育高效油脂降解菌株
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中图分类 号 ： Ｘ ７ １２ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２— ３ ２ ２ １ ）２— ２ ５—０ １Βιβλιοθήκη Baidu １０ （０ ２ ０ ０ ９ ２
脂 肪 酶 （ｉａｅ Ｅ ３ １ １ ３） 一 类 特 殊 的 酯 键 水 解 １ ｓ， Ｃ ． ． ． 是 ｐ 酶 ， 最 早 被 研 究 的 酶 类 之 一 ， 广 泛 应 用 于 食 品 、 药 、 是 被 医
１３ 培 养 基 ．
的菌液稀 释到 １ ～， Ｏ 以未 经化学诱 变处 理 的出发 菌 为对照 ，
１４ ３ Ｄ Ｓ诱变处理 ． ． Ｅ
以紫外线诱 变所得 的脂肪酶活性
最高 的菌株作为出发菌株 ， 进行硫酸二乙酯诱 变。取 ４ｍ Ｌ菌
悬液 １ ２份 ， 浓 度 为 ２ 的 Ｄ Ｓ溶 液 ４ｍ 与 ％ Ｅ Ｌ以 ５： ５的 比例 混
合， ２ 在 ０℃振荡处理 ， 分别振荡处理 ０ ２ 、０ ４ 、０ ６ ｉ， 、Ｏ ３ 、０ ５ 、０ｒ ｎ ａ
用紫外 线 、 学 诱 变剂——硫 酸 二 乙酯 （ Ｅ ） 初 筛 菌株 化 ＤＳ对
Ｂ ｉｕ ｓ．Ｃ ４进行复合诱 变来提高 产酶菌 的产酶性 能 ， ｃ ｌ ａ ｌ ｐ Ｓ一 ｓ 以期为油脂下脚料残油高效降解提供具有应用 价值 的菌株 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌株 ．
８ ２型离心机（ ０— 江苏 金 坛 市 中 大仪 器 厂 生 产 ） 电 子 天平 、
（ 梅特勒电子仪 器有 限公 司生产 ） 电炉 （ 、 天津 市泰斯 特仪器 有限公 司生产 ） 超净工作 台（ 、 江苏净化设备 厂生产 ） 立式压 、 力蒸 汽 灭 菌 锅 （ 上海 申安 医疗 器 械 厂 生 产 ） 生化 培 养箱 、
为 ７ ５ ．。
１４ 试 验 方 法 ．
化妆 品、 洗涤、 皮革 、 造纸 等领域
。近年来 ， 内外对生物 国
１４ １ 悬浮液制备 ．．
用生理盐水制备菌悬液 ， 加入玻璃珠振
法处理含油废水 的研究逐 渐形成热 点 ， 重视各类油 脂废水废 渣 的生物 降解研究 ， 可以有效地解 决这些废 弃物所 带来 的环 境污染 问题 。如何提高脂 肪酶活性 是技术难 题 ， 目前野生 且 型菌种 的脂肪酶活性相对较低 ， 因此 ， 利用各种诱变手段选育 高产脂肪酶生产菌一直是 国内外研究的重点。本研究通过利
江苏农业科学
２１ ０ ２年第 ４ Ｏ卷第 ２期
． ９ ． ． — ５． —２ — —
罗跃 中， 兰立新 ， 吴永尧．紫外线与硫 酸二乙酯复合诱 变选 育高效 油脂 降解菌株 ［ ］ Ｊ ．江苏农 业科 学， １ ， （ ） ２ ５ ２７ ２ ２４ ２ ： — ９ ０ ０ ９
紫外线与硫酸二 乙酯复合诱变选育高效油脂 降解菌株
罗跃 中 ，兰立 新 ，吴 永尧
（． １ 湖南化工职业技术学院 ， 湖南株洲 ４ ２ ０ ； ． １０４ ２ 湖南农业大学生命科学 院， 湖南长沙 ４ ０ ２ ） １ １ ８
摘要 ： 为了提高油脂降解菌 的降解 能力 ， Ｂ ｃｌ ｐ Ｓ一 以 ａｉｕ ｓ．Ｃ ４为出发菌株 ， ｌｓ 进行 了紫外线与硫酸二 乙酯复合诱变 处理 ， 到了 １ 稳定 高效的 目的菌株 ， 名为 Ｂ ｃ ｌ ｐ Ｅ一８ 其脂 肪酶活性 为 １ ．５Ｕ ｍ 比出发 菌株提 高了 得 株 命 ａｉｕ ｓ．Ｄ ｌ ｓ ， ４ ８ ／ Ｌ， １ ． ％。对 Ｂ ｉｕ ｐ Ｅ一 ５２ ｃ ｌ ａ ｌ ｓｓ．Ｄ ８进行 ５次传代试验 ， 脂肪酶活性平均值为 １ ．０ Ｕ ｍ 表 明该菌株遗传稳定性较好 。 ４ ９ ／ Ｌ， 关键词 ：油脂降解菌 ； 紫外线 ； 硫酸二 乙酯 ； 复合诱变 ； 肪酶 脂
发 酵 液 的脂 肪 酶 活 性 。
前期筛选得到 的油 脂 降解优 势菌 Ｂ ｃ ｌ ｐ ｓ一 ａｉｕ ｓ．ｃ ４由 ｌ ｓ
湖 南 化 工 职 业 技 术 学 院 国家 生 物 制 药 基 地 保藏 。
１２ 主要 仪 器 和设 备 ．
Ｕ Ｖ一２ ５ ５ ０紫外 分 光 光度 计 （日本 岛 津 制作 所 生 产 ） 、
最 后 加 入 １ Ｌ２ ％硫 代 硫 酸 钠 溶 液 中止 反 应 。将 诱 变 处 理 ０ｍ ５
（ Ｐ ２０ （ Ｈ Ｓ一 ５ ） 哈尔滨 市东 明医疗仪 器 厂生产 ） 恒 温水浴 箱 、
（ Ｄ Ｘ一 ０ Ａ ） 上海瑞仰净化装备有限公司生产 ）全 温空 Ｌ Ｚ ５Ｆ Ｓ （ 、 气摇床 （ Ｙ ２ ） 上海福玛实验设 备有限公 司生产 ） Ｑ Ｃ一 １ （ 。
荡分散 ， 以无菌滤纸 或脱 脂棉过滤 ， 使形成单 细胞 ， 分散程度
达 ９ ％ 以上 。要求在诱 变前对菌液进行稀释 。 ０
１４ ２ 紫外线诱变 ．．
采取无 菌操作 ， 取活化后 的油脂 降解优
势菌 （ Ｓ一 ） Ｃ ４ ２环于盛有 １０ｍ ５ Ｌ无菌水 的三角瓶 中， 加入无
菌玻璃珠并置摇床 上振荡 ２ ｎ混合均匀 ， ０ｍｉ 然后配成 １５— ０
１８ ＇ｍ ０ － Ｌ的菌悬 液。各取 ｆ ｍ Ａ／ ｏ Ｌ处理 好 的菌悬 液放 入 １ ４
个无菌培养皿 中， 依次放置于距 ３ 紫外灯 ３ ｍ处的磁力 ０ｗ ０ｃ
搅拌器上 ， 打开培养皿盖并 开启磁 力搅拌器 ， 照射 ０ 对 分别 （
照 ） ２ 、０ ６ 、０ １０ １０ｓ 做 ２组 平行样 ） 、０４ 、０ ８ 、０ 、２ （ 。在 暗光环境 下， 分别取经 紫外线诱变 的菌悬 液 ０ ２ｍ ． Ｌ涂布于 １ ４个 固体 平板培养基上 ， 扎后倒 置于 ３ 包 ５℃ 恒温 培养箱 中避 光培养 ３ｄ计算致死率 。挑取菌落较厚且大的菌株 ２ ， ０个 ， 编号后 接 种于试管斜面保藏 ， 同时取对应 的菌 株接入 ２ ０ｍ ５ Ｌ摇 瓶 （ 装 液量为 ５ Ｅ 中 ， ０ｍ ） 置于 ３ Ｃ、 ８ ｍｉ 床培养 ５ ｄ 测定 ０ ｏ １０ ｒ ｎ摇 ／ ，
脂 肪 酶 （ｉａｅ Ｅ ３ １ １ ３） 一 类 特 殊 的 酯 键 水 解 １ ｓ， Ｃ ． ． ． 是 ｐ 酶 ， 最 早 被 研 究 的 酶 类 之 一 ， 广 泛 应 用 于 食 品 、 药 、 是 被 医
１３ 培 养 基 ．
的菌液稀 释到 １ ～， Ｏ 以未 经化学诱 变处 理 的出发 菌 为对照 ，
１４ ３ Ｄ Ｓ诱变处理 ． ． Ｅ
以紫外线诱 变所得 的脂肪酶活性
最高 的菌株作为出发菌株 ， 进行硫酸二乙酯诱 变。取 ４ｍ Ｌ菌
悬液 １ ２份 ， 浓 度 为 ２ 的 Ｄ Ｓ溶 液 ４ｍ 与 ％ Ｅ Ｌ以 ５： ５的 比例 混
合， ２ 在 ０℃振荡处理 ， 分别振荡处理 ０ ２ 、０ ４ 、０ ６ ｉ， 、Ｏ ３ 、０ ５ 、０ｒ ｎ ａ
用紫外 线 、 学 诱 变剂——硫 酸 二 乙酯 （ Ｅ ） 初 筛 菌株 化 ＤＳ对
Ｂ ｉｕ ｓ．Ｃ ４进行复合诱 变来提高 产酶菌 的产酶性 能 ， ｃ ｌ ａ ｌ ｐ Ｓ一 ｓ 以期为油脂下脚料残油高效降解提供具有应用 价值 的菌株 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌株 ．
８ ２型离心机（ ０— 江苏 金 坛 市 中 大仪 器 厂 生 产 ） 电 子 天平 、
（ 梅特勒电子仪 器有 限公 司生产 ） 电炉 （ 、 天津 市泰斯 特仪器 有限公 司生产 ） 超净工作 台（ 、 江苏净化设备 厂生产 ） 立式压 、 力蒸 汽 灭 菌 锅 （ 上海 申安 医疗 器 械 厂 生 产 ） 生化 培 养箱 、
为 ７ ５ ．。
１４ 试 验 方 法 ．
化妆 品、 洗涤、 皮革 、 造纸 等领域
。近年来 ， 内外对生物 国
１４ １ 悬浮液制备 ．．
用生理盐水制备菌悬液 ， 加入玻璃珠振
法处理含油废水 的研究逐 渐形成热 点 ， 重视各类油 脂废水废 渣 的生物 降解研究 ， 可以有效地解 决这些废 弃物所 带来 的环 境污染 问题 。如何提高脂 肪酶活性 是技术难 题 ， 目前野生 且 型菌种 的脂肪酶活性相对较低 ， 因此 ， 利用各种诱变手段选育 高产脂肪酶生产菌一直是 国内外研究的重点。本研究通过利
江苏农业科学
２１ ０ ２年第 ４ Ｏ卷第 ２期
． ９ ． ． — ５． —２ — —
罗跃 中， 兰立新 ， 吴永尧．紫外线与硫 酸二乙酯复合诱 变选 育高效 油脂 降解菌株 ［ ］ Ｊ ．江苏农 业科 学， １ ， （ ） ２ ５ ２７ ２ ２４ ２ ： — ９ ０ ０ ９
紫外线与硫酸二 乙酯复合诱变选育高效油脂 降解菌株
罗跃 中 ，兰立 新 ，吴 永尧
（． １ 湖南化工职业技术学院 ， 湖南株洲 ４ ２ ０ ； ． １０４ ２ 湖南农业大学生命科学 院， 湖南长沙 ４ ０ ２ ） １ １ ８
摘要 ： 为了提高油脂降解菌 的降解 能力 ， Ｂ ｃｌ ｐ Ｓ一 以 ａｉｕ ｓ．Ｃ ４为出发菌株 ， ｌｓ 进行 了紫外线与硫酸二 乙酯复合诱变 处理 ， 到了 １ 稳定 高效的 目的菌株 ， 名为 Ｂ ｃ ｌ ｐ Ｅ一８ 其脂 肪酶活性 为 １ ．５Ｕ ｍ 比出发 菌株提 高了 得 株 命 ａｉｕ ｓ．Ｄ ｌ ｓ ， ４ ８ ／ Ｌ， １ ． ％。对 Ｂ ｉｕ ｐ Ｅ一 ５２ ｃ ｌ ａ ｌ ｓｓ．Ｄ ８进行 ５次传代试验 ， 脂肪酶活性平均值为 １ ．０ Ｕ ｍ 表 明该菌株遗传稳定性较好 。 ４ ９ ／ Ｌ， 关键词 ：油脂降解菌 ； 紫外线 ； 硫酸二 乙酯 ； 复合诱变 ； 肪酶 脂
发 酵 液 的脂 肪 酶 活 性 。
前期筛选得到 的油 脂 降解优 势菌 Ｂ ｃ ｌ ｐ ｓ一 ａｉｕ ｓ．ｃ ４由 ｌ ｓ
湖 南 化 工 职 业 技 术 学 院 国家 生 物 制 药 基 地 保藏 。
１２ 主要 仪 器 和设 备 ．
Ｕ Ｖ一２ ５ ５ ０紫外 分 光 光度 计 （日本 岛 津 制作 所 生 产 ） 、
最 后 加 入 １ Ｌ２ ％硫 代 硫 酸 钠 溶 液 中止 反 应 。将 诱 变 处 理 ０ｍ ５
（ Ｐ ２０ （ Ｈ Ｓ一 ５ ） 哈尔滨 市东 明医疗仪 器 厂生产 ） 恒 温水浴 箱 、
（ Ｄ Ｘ一 ０ Ａ ） 上海瑞仰净化装备有限公司生产 ）全 温空 Ｌ Ｚ ５Ｆ Ｓ （ 、 气摇床 （ Ｙ ２ ） 上海福玛实验设 备有限公 司生产 ） Ｑ Ｃ一 １ （ 。
荡分散 ， 以无菌滤纸 或脱 脂棉过滤 ， 使形成单 细胞 ， 分散程度
达 ９ ％ 以上 。要求在诱 变前对菌液进行稀释 。 ０
１４ ２ 紫外线诱变 ．．
采取无 菌操作 ， 取活化后 的油脂 降解优
势菌 （ Ｓ一 ） Ｃ ４ ２环于盛有 １０ｍ ５ Ｌ无菌水 的三角瓶 中， 加入无
菌玻璃珠并置摇床 上振荡 ２ ｎ混合均匀 ， ０ｍｉ 然后配成 １５— ０
１８ ＇ｍ ０ － Ｌ的菌悬 液。各取 ｆ ｍ Ａ／ ｏ Ｌ处理 好 的菌悬 液放 入 １ ４
个无菌培养皿 中， 依次放置于距 ３ 紫外灯 ３ ｍ处的磁力 ０ｗ ０ｃ
搅拌器上 ， 打开培养皿盖并 开启磁 力搅拌器 ， 照射 ０ 对 分别 （
照 ） ２ 、０ ６ 、０ １０ １０ｓ 做 ２组 平行样 ） 、０４ 、０ ８ 、０ 、２ （ 。在 暗光环境 下， 分别取经 紫外线诱变 的菌悬 液 ０ ２ｍ ． Ｌ涂布于 １ ４个 固体 平板培养基上 ， 扎后倒 置于 ３ 包 ５℃ 恒温 培养箱 中避 光培养 ３ｄ计算致死率 。挑取菌落较厚且大的菌株 ２ ， ０个 ， 编号后 接 种于试管斜面保藏 ， 同时取对应 的菌 株接入 ２ ０ｍ ５ Ｌ摇 瓶 （ 装 液量为 ５ Ｅ 中 ， ０ｍ ） 置于 ３ Ｃ、 ８ ｍｉ 床培养 ５ ｄ 测定 ０ ｏ １０ ｒ ｎ摇 ／ ，