第十章亲和色谱共74页

亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列
噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群体→ 氨基酸序列
SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作
概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择 性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性 相互作用称为亲和作用。
静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。 生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-
受体等亲和作用。
常见亲合作用体系
特异性 高特异性
群特异性
亲和体系
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine） 可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋 白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异 性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分 辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容 量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了 广泛的应用。
磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸 脱氢酶有吸附力。
22
配基分子的大小
选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载体
和配基间插入一个“手臂” 以消除空间障碍。
23
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分
子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团） 发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应 速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂 （inhibitor）。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝 胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分 为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、 酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的 特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的 特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异 性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的 生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实 验。
配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓 度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
21
配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结合的 部位与载体进行偶联。
腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢 酶和甘油激酶有吸附力。
7
配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分 离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用 的物质
找与底物专一可逆结 合的配基；
将配基通过共价键偶 联到基质；
配基与底物吸附； 洗脱目标物。
6
亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋
白 酶－底物、产物、抑制剂
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞
表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌
等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
影响亲和作用的因素
是亲和分离技术中最具优势的方法
平衡
源自文库混合蛋白样
液
品
带有配体的树 脂珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大
分子 3、纯化倍数大，产物纯度高 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的
层析条件 5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入
产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择 理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。 5．适当的多孔性。
用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性 结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类 或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分 子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建 立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完 成破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下， 亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用 4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，
疏水性相互作用增强 5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱 6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结 合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损 害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的 生物大分子，也有小分子化合物。