1---血凝和血凝抑制实验

抗原
抗体
I am late！
血凝试验（HA)
1、血凝板上的1-12孔每孔加入25ul生理盐水 2、在第1孔内加入25ul抗原，反复吸吹3-5次使其混 匀，然后从第一孔吸取25 ul加入到第二孔，又反复 洗吹3.5次吸取25 ul加入到第三孔，依次倍比稀释至 第11孔，最后从11孔弃去25ul 3、每孔再次加入生理盐水25ul 4、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul 5、在振荡器上振荡均匀后，放于室温（20-25°C） 下静置30分钟，或2-8℃45-60分钟，红细胞对照孔 呈纽扣状时判定结果。 6、结果判定。将反应板倾斜60°，观察红细胞有无 泪滴状流淌，完全凝集无泪珠状流淌（100%）的最 高稀释倍数为抗原血凝价。
注意事项
5、4个单位抗原配备一定要准确，如果配备的抗原效价高，那么抗体滴 度就会低，反之抗体滴度会高，一般现用现配 。回归试验来判定效价测定的 正确与否。做法：做四排，每排的1-4孔加入生理盐水50UL，取配好的四个单 位抗原50UL与第一孔做倍比稀释至最后一孔并弃掉50UL，最后每孔加入 50UL红细胞悬液，震荡，静置20分钟观察结果。如果第一和第二孔完全凝集 不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，则说明四个单位抗原配制正确。 6、红细胞悬液在洗涤的过程中一定要把白细胞膜吸取干净，颜色为鲜红 色，如果是暗红色很有可能发生了溶血。如果采集的红细胞免疫过禽流感， 那么可以多洗涤几遍。红细胞悬液一般情况下可以存放3天，如果要保持一周 左右就要在无菌情况下存放在阿氏保护液中。
注意事项
7、环境温度一定要重视，一般要求在室温下20-25°进行， 如果低于15°反应结果就出现的慢；如果高于30°结果会出现的 快；如果低于4°会发生红细胞自凝现在。因此，观察时间可以 适当根据反应情况缩短，所以实验室要装有空调和温度计。
8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底 要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验 中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝 这种情况。
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+++
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++
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－
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－（红 细胞沉 积在底
抗原效价29
检测质量控制措施
标准、 规范
注 意
优质的试剂
Байду номын сангаас
充分准备！！！
校准的仪器
正确的操作
注意事项
1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；
2、移液器的吸头在反复洗吹时要插入液面以下但不可过深， 避免使用中速度过快产生过多气泡造成移液量减少，每孔混匀完毕 要将吸头内液体排尽。
注意事项
3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢固，防止 使用过程中漏气或者掉落。吸头尽量使用一次性的，若反复使用要清 洗干净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，如果发现吸头 堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。 4、移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要 深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬 空垂直加样。
1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地 使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的 现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞 不流淌）。
病 毒 颗 粒
红 细 胞
2、HI原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这 种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细 胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑 制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
注意事项
9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为 12。原因分析：1、 4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环 境温度过高；3、读数时间拖延；4、没有加4个单位抗原。 10、整板红细胞凝集（不流淌）现象，原因分析：红细胞受污染 或保存时间过长；4个单位抗原配制失败或滴加失误；生理盐水受到 污染。 11、跳孔：倍比稀释时顺序错乱；移液器吸取的量不准确。
做好个人防护
4个单位抗原配制
例如：抗原效价的最高稀释倍数为28（1： 256）， 则4个单位抗原为26，256÷4=1:64， 即在63毫升的PBS液中加入1毫升抗原即可。
血凝抑制试验
1、 在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水； 2、 在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第10孔，最 后从第10孔中吸取25ul弃掉； 3、 第1－11孔内加入4单位抗原25ul（第11孔为抗原对照第） 4、 振荡混匀，放于室温中静置30分钟或2-8°50分钟； 5、 1-12孔每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul （12孔为红细胞对 照 ）； 6、 振荡，放于室温静置30分钟，或2-8℃45-60分钟； 7、 结果判定。以完全抑制的4个单位抗原的最高稀释倍数为该 血清的HI效价。滴度≤23为阴性，≥ 24为阳性。 8、见下图
下图中的抗体效价依次为
28、20、25、28
抗体滴度：9、1、6、0、5、0、0；阳性对 照：9
下图中的抗体效价均为阴性，红细胞对照12孔成立（流淌）， 11孔抗原对照不流淌。
1%红细胞悬液的制备
采集2-3只健康成年公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的 健康公鸡血液与等体积的阿氏保护液（3.8%抗凝剂）混合， 用PBS液（生理盐水代替）洗涤3次，吸掉血浆和白细胞膜， 每次以3000转/分钟离心3-5分钟，洗至上清液由淡黄色变为 透明色。最后用移液器或者刻度吸管吸取压积的红细胞泥， 用PBS配制成1%的悬液，于4℃保存备用。（1份红细胞泥 +9份生理盐水）
H7亚型禽流感 血凝抑制试验
鲜海梅
内 容
1、血凝试验(HA)：检测抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)：检测抗体 3、注意事项
材料
1、90°的96孔微量反应板、单道及多道微量移液器、吸头、加样槽、烧 杯、吸管、量杯、微量振荡器； 2、H7亚型禽流感抗原、阴阳性血清、稀释液（PBS）；
实验原理
阿氏保护液配制：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠 0.8克，柠檬酸（枸橼酸 ）0.055克，氯化钠 0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后 调PH值至6.1，然后高压灭菌15分钟，2-8° 保存备用 3.8%抗凝剂配制：枸橼酸钠3.8克，加入蒸馏 水100毫升。 PBS液：用临床用生理盐水代替。配方略。
抗原效价测定
1 2 ×
生 理 盐 水 抗 原 生 理 盐 水 红 细 胞 结 果
2 4 × 25
3 8 × 25
4 16 × 25
5 32 × 25
6 64 × 25
7 128 × 25
8 256 × 25
9 512 × 25
10 1024 × 25
11 2048 × 25
12 红细 胞对 照 25