1---血凝和血凝抑制实验
血凝及血凝抑制实验
实验原理基于病毒与抗体结合 后，改变了红细胞的抗原性，
从而影响血凝过程
实验结果可用于病毒的分离、 鉴定和抗体效价测定等
实验材料
血凝抑制抗体 病毒抗原 受检血清 红细胞
实验步骤
准备试剂和器材：包括血凝试剂、抗体、离心机、试管等。 采集样本：采集待检测动物的血液样本。 抗体处理：将抗体与待检测样本混合，孵育一定时间。 离心分离：将混合液离心，分离出凝集块。 结果观察：观察凝集块的数量和大小，判断实验结果。
实验结果
添加 标题
实验原理：血凝抑制实验的原理是利用抗原抗体反应的特异性，通过加入抗体来抑制血凝反应的发生，从而 检测出血液中是否存在相应的抗体。
添加 标题
实验步骤：血凝抑制实验通常包括加样、加抗体、观察结果等步骤。在实验过程中，需要严格控制实验条件， 以保证实验结果的准确性和可靠性。
添加 标题
实验结果分析：根据实验结果，可以判断出被检测样本中是否存在相应的抗体。如果血凝反应被抑制，则说明被检测样本中 存在相应的抗体；如果没有出现血凝反应或者血凝反应没有被抑制，则说明被检测样本中不存在相应的抗体。
诊断试剂开发：利用 血凝及血凝抑制实验 检测血液中的病毒抗 体，辅助临床诊断
在食品科学领域的应用
食品安全：评估食品中细菌、 病毒等微生物的污染程度
食品加工：检测食品中病原 微生物的含量
食品质量控制：监测生产过程 中的卫生状况，确保产品质量
食品科学研究：为食品科学 领域的研究提供数据支持
在其他领域的应用
评估风险：对于需要进行手术或特殊治疗的患者，血凝及血凝抑制实验可以评估其出 血风险
科学研究：在医学研究中，血凝及血凝抑制实验可用于研究凝血机制、药物作用等方 面
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
医学课件ppt
7
血凝效价测定
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8
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
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10
血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
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16
注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
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13
01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
1%红 细胞
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
病毒 液
25
25
从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
实验四血凝和血凝抑制试验课件
02
实验材料
实验器材
01
02
试管
用于血样的采集、分离和反应 。
吸管
用于吸取试剂和血样。
03
离心机
用于血样的分离。
04
显微镜
用于观察血凝现象。
实验试剂
生理盐水
用于稀释血样和作为反应介质 。
抗血清
用于血凝抑制试验，针对特定 病毒或细菌。
凝血酶
促使血液凝固的酶。
抗凝剂
如肝素，防止血液凝固。
实验样本
出了抗体滴度与病毒滴度之间的关系。这一发现有助于评估抗体治疗效
果和制定抗病毒治疗方案。
05
注意事项与安全须知
实验安全须知
01
实验操作应在专业人员 的指导下进行，确保安 全。
02
实验过程中应穿戴实验 服和防护眼镜，避免意 外伤害。
03
实验器材应保持清洁， 避免交叉污染。
04
实验废弃物应按照规定 进行处理，避免对环境 和人体造成危害。
血凝抑制试验
利用抗体与相应抗原结合后，抑 制红细胞发生凝集的现象。
实验步骤
准备试剂和器材：包括抗 原、抗体、红细胞、生理 盐水等。
制备不同浓度的抗原溶液。
取适量红细胞，加入不同 浓度的抗原溶液中，观察 红细胞是否发生凝集。
记录实验结果，分析数据， 得出结论。
对于血凝抑制试验，先加 入抗体，再加入抗原溶液， 观察红细胞是否发生凝集。
实验结果
实验结果一
实验结果三
血凝试验中，不同稀释度的病毒液与 红细胞混合后，红细胞迅速凝结成块， 形成明显的血凝现象。
通过比较不同稀释度的病毒液与加入 特异性抗体后的血凝抑制情况，可以 得出抗体滴度与病毒滴度之间的关系。
血凝和血凝抑制试验原理(一)
血凝和血凝抑制试验原理(一)血凝和血凝抑制试验1. 概述血凝和血凝抑制试验是一种常见的临床实验室检查方法，用于评估血液凝结和抗凝功能。
它可以帮助医生判断个体的凝血状态，从而进行相应的治疗和预防措施。
2. 血凝原理血液的凝结是一种复杂的生理过程，涉及多种凝血因子和细胞的相互作用。
当大血管破裂时，损伤的组织会释放一种称为组织因子的物质，它与循环中的凝血因子相互作用，引发一系列的凝血反应。
凝血反应中，血浆中的凝血因子会被激活并相互作用，最终形成稳定的纤维素凝块，促使伤口止血。
这个过程中，包括凝血因子I（纤维原）、II（凝血酶原）、III（组织因子）等在内的多个物质起到关键作用。
3. 血凝抑制原理为了避免血液在正常情况下过度凝结，人体内也存在一系列抗凝物质。
这些抗凝物质包括抗凝酶、抗凝素、溶纤酶等，并与凝血因子形成复杂的调控网络。
血凝抑制试验通过检测这些抗凝物质的活性，来评估抗凝功能的正常与否。
常见的血凝抑制试验包括凝血酶时间（TT）、部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原等。
4. 血凝和血凝抑制试验的应用血凝和血凝抑制试验广泛应用于临床诊断和治疗中。
通过这些试验可以帮助医生判断患者的凝血功能是否正常，从而指导药物治疗和手术操作。
一些疾病，例如血栓性疾病和出血性疾病，都与凝血功能紊乱有关。
通过血凝和血凝抑制试验，可以及早发现这些疾病的存在并进行治疗。
此外，血凝和血凝抑制试验还被广泛用于药物研发和安全性评价。
一些药物可以影响凝血功能，通过检测血液的凝血和抗凝状态，可以评估药物的药理学性质和安全性。
5. 结语血凝和血凝抑制试验是一项重要的临床实验室检查方法，可以帮助医生评估患者的凝血功能和抗凝功能。
它在临床诊断、治疗和药物安全性评价中发挥着重要作用。
通过这些试验，我们可以更好地了解人体的生理状态，并为临床工作提供有力的支持。
6. 试验过程血凝和血凝抑制试验通常需要在临床实验室进行，以下是一般的试验过程：1.采集血样：先使用消毒剂清洁采血点，然后使用注射针和导管采集适量的静脉血。
血凝和血凝抑制试验操作要领
血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是目前我国各地对新城疫、禽流感等疾病进行流行病学调查、疫病诊断、防疫监测、免疫程序制定等工作的主要依据，各大型养殖场、兽医门市、畜牧局、兽药疫苗生产厂家均可以进行操作。
该试验方法具有经济、快速、可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽类血样的抗体滴度水平。
但是实验用材料不标准、操作不规范等因素也会影响到试验结果的准确性，导致试验的失败。
笔者就血凝-血凝抑制试验中关键步骤介绍如下，供同行参考。
1原理说明某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒。
2试验前准备2.196孔V型微量反应板选用规则标准的96孔V型微量反应板，V型孔底需光滑明亮，对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。
使用前先用酒精棉擦拭干净，再用蒸镏水反复冲洗多次，在温箱中烘干备用；使用后及时将反应板用自来水反复冲洗(以孔底不留沉积的红血球为准)，再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自来水反复冲净每个凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2％～3％浓度的盐酸中浸泡24h以上。
2.2待检血清用于分离血清的血液必须是新鲜无污染的，采集血样后置于硅化管或一次性塑料离心管内，水平放置，保证血样与空气最大限度的接触，先置于37℃环境下半小时，再置于4℃环境下数小时，8000～10000r/min离心3~5min，将析出的血清移入清洁的包装内备用。
4℃的冰箱中冷藏可保存5d，长时间保存可冷冻存放，冷冻后会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象，在检测前应充分混匀。
2.31%红细胞最好选用健康、未经过疫苗免疫的成年SPF公鸡，如若没有SPF公鸡也可以使用低抗体鸡提供的红细胞但需要更多次的洗涤(5遍以上)，建议用3只以上鸡的血液混合制备红细胞悬液。
血凝与血凝抑制试验(附思考题及答案)
五、结果判定
• 血凝试验：根据血凝价稀释病毒悬液 • 血凝抑制试验：血凝抑制试验效价：出现完全血凝抑制时的最高
血清稀释度。
Байду номын сангаас
六、思考题
• 1、血凝价判定偏高或者偏低对血凝抑制价的判定结果有什么 影响？
• 若血凝价判定偏高，即稀释的倍数偏高，使得病毒浓度未达 到要求的4个血凝单位，则需要中和病毒的血清更少，即血清 的稀释倍数更大，因此结果会偏高。
将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液备 用 • 0·85%生理盐水 • 鸡血清
四、实验步骤
• （一）血凝试验 • 1～12孔加入生理盐水 • 第一孔加入50ul病毒悬液，倍比稀释至第11孔 • 1～12孔加入1%的红细胞50ul • 震荡后置于37度恒温箱25～30min后，观察结果 • 病毒的血凝价？ • 病毒的血凝价：能使红细胞产生50%凝集的病毒最高稀释度。
血凝和血凝抑制试验
安尧o
一、实验目的
• 1、掌握病毒血凝与血凝抑制试验的原理。 • 2、掌握试验的设计、操作步骤和结果的判定。
二、实验原理
• 血凝试验（HA）：
• 血凝抑制试验（HI）：
• 某些病毒能够使动物的红细胞发 生凝集现象。
• 红细胞凝集的本质是抗原-抗体 反应，红细胞表面存在凝集原
• 在病毒悬液中加入特异性抗体
• 2、血凝和血凝抑制试验的应用？ • 血凝试验可以检测某种病毒是否具有凝集红细胞的能力，测
定病毒的血凝价、滴度，血凝抑制试验可以检测抗体是否有 效，抗体的效价。
请在此处添加标题
• （二）血凝抑制试验 • 1～11孔加入25ul生理盐水 • 第1孔加待检血清25ul，倍比稀释至第10孔 • 1～11孔加入25ul4个血凝单位的病毒悬液 • 1～12孔加入1%红细胞50ul • 震荡后置37度恒温箱25~30min观察结果。 • 红细胞凝集100%的抑制作为结果判定的终点
血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制（HI）试验操作规程1.仪器、设备和试剂的准备1.1仪器及设备V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI抗原1.2.2相应阳性血清1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。
按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。
（按照需要量配制）1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml2．HI抗原工作液配制2.1HI抗原血凝价测定血凝试验：1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1病毒血凝试验孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果图1如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI抗原工作液配制及检验2.2.14HA100单位的抗原配制4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA100单位抗原的检验4HA100单位抗原的检验按表2进行。
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
血凝和血凝抑制实验
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝和血凝抑制实验
一、重要性
01 有效预防动物疫情的发生 02 有效判断动物疫情发生的原因 03 有效推动动物免疫程序的制定
二、检测内容和方法
检测内容
猪
猪瘟 O型口蹄疫 A型口蹄疫 地方病：蓝耳、细 小、圆环、伪狂犬、 乙脑
羊
O型口蹄疫 小反刍兽疫
牛
O型口蹄疫 A型口蹄疫
鸡
禽流感 新城疫
用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴 定该特异性抗体的水平。
血凝试验：某种病毒的血凝素， 能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝 集，叫做血凝试验，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试 验称血凝试验 (HA) 。
常见于正粘病毒、副粘病毒和某 些黄病毒、痘病毒等。
目的：测定病毒的血凝效价，采用 一定的病毒量，通常采用4个血凝 单位
2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以 2000~3000r/min，5~10min离心3-5次。
3.弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液， 上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心 弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散 热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌， 4℃保存备用。
1%红细胞的配制：
1.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好 选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与 血液比例为1:4）
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验（HI）原理
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做好个人防护
注意事项
7、环境温度一定要重视，一般要求在室温下20-25°进行， 如果低于15°反应结果就出现的慢；如果高于30°结果会出现的 快；如果低于4°会发生红细胞自凝现在。因此，观察时间可以 适当根据反应情况缩短，所以实验室要装有空调和温度计。
8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底 要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验 中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝 这种情况。
检测质量控制措施
标准、 规范
注 意
优质的试剂
充分准备！！！
校准的仪器
正确的操作
注意事项
1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；
2、移液器的吸头在反复洗吹时要插入液面以下但不可过深， 避免使用中速度过快产生过多气泡造成移液量减少，每孔混匀完毕 要将吸头内液体排尽。
注意事项
3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢固，防止 使用过程中漏气或者掉落。吸头尽量使用一次性的，若反复使用要清 洗干净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，如果发现吸头 堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。 4、移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要 深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬 空垂直加样。
1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地 使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的 现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞 不流淌）。
病 毒 颗 粒
红 细 胞
2、HI原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这 种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细 胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑 制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
弃25
25 25
＋＋ ＋＋
25 25
＋＋ ＋＋
25 25
＋＋ ＋＋
25 25
＋＋ ＋＋
25 25
＋＋ ＋＋
25 25
＋＋ ＋ +
25 25
＋＋ ＋ +
25 25
＋＋ ＋ +
25 25
+++
25 25
++
25 25
－
25 25
－（红 细胞沉 积在底
抗原效价29
阿氏保护液配制：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠 0.8克，柠檬酸（枸橼酸 ）0.055克，氯化钠 0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后 调PH值至6.1，然后高压灭菌15分钟，2-8° 保存备用 3.8%抗凝剂配制：枸橼酸钠3.8克，加入蒸馏 水100毫升。 PBS液：用临床用生理盐水代替。配方略。
抗原效价测定
1 2 ×
生 理 盐 水 抗 原 生 理 盐 水 红 细 胞 结 果
2 4 × 25
3 8 × 25
4 16 × 25
5 32 × 25
6 64 × 25
7 128 × 25
8 256 × 25
9 512 × 25
10 1024 × 25
11 2048 × 25
12 红细 胞对 照 25
注意事项
9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为 12。原因分析：1、 4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环 境温度过高；3、读数时间拖延；4、没有加4个单位抗原。 10、整板红细胞凝集（不流淌）现象，原因分析：红细胞受污染 或保存时间过长；4个单位抗原配制失败或滴加失误；生理盐水受到 污染。 11、跳孔：倍比稀释时顺序错乱；移液器吸取的量不准确。
4个单位抗原配制
例如：抗原效价的最高稀释倍数为28（1： 256）， 则4个单位抗原为26，256÷4=1:64， 即在63毫升的PBS液中加入1毫升抗原即可。
血凝抑制试验
1、 在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水； 2、 在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第10孔，最 后从第10孔中吸取25ul弃掉； 3、 第1－11孔内加入4单位抗原25ul（第11孔为抗原对照第） 4、 振荡混匀，放于室温中静置30分钟或2-8°50分钟； 5、 1-12孔每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul （12孔为红细胞对 照 ）； 6、 振荡，放于室温静置30分钟，或2-8℃45-60分钟； 7、 结果判定。以完全抑制的4个单位抗原的最高稀释倍数为该 血清的HI效价。滴度≤23为阴性，≥ 24为阳性。 8、见下图
下图中的抗体效价依次为
28、20、25、28
抗体滴度：9、1、6、0、5、0、0；阳性对 照：9
下图中的抗体效价均为阴性，红细胞对照12孔成立（流淌）， 11孔抗原对照不流淌。
1%红细胞悬液的制备
采集2-3只健康成年公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的 健康公鸡血液与等体积的阿氏保护液（3.8%抗凝剂）混合， 用PBS液（生理盐水代替）洗涤3次，吸掉血浆和白细胞膜， 每次以3000转/分钟离心3-5分钟，洗至上清液由淡黄色变为 透明色。最后用移液器或者刻度吸管吸取压积的红细胞泥， 用PBS配制成1%的悬液，于4℃保存备用。（1份红细胞泥 +9份生理盐水）
H7亚型禽流感 血凝抑制试验
鲜海梅
内 容
1、血凝试验(HA)：检测抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)：检测抗体 3、注意事项
材料
1、90°的96孔微量反应板、单道及多道微量移液器、吸头、加样槽、烧 杯、吸管、量杯、微量振荡器； 2、H7亚型禽流感抗原、阴阳性血清、稀释液（PBS）；
实验原理
抗原
抗体
I am late！
血凝试验（HA)
1、血凝板上的1-12孔每孔加入25ul生理盐水 2、在第1孔内加入25ul抗原，反复吸吹3-5次使其混 匀，然后从第一孔吸取25 ul加入到第二孔，又反复 洗吹3.5次吸取25 ul加入到第三孔，依次倍比稀释至 第11孔，最后从11孔弃去25ul 3、每孔再次加入生理盐水25ul 4、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul 5、在振荡器上振荡均匀后，放于室温（20-25°C） 下静置30分钟，或2-8℃45-60分钟，红细胞对照孔 呈纽扣状时判定结果。 6、结果判定。将反应板倾斜60°，观察红细胞有无 泪滴状流淌，完全凝集无泪珠状流淌（100%）的最 高稀释倍数为抗原血凝价。
注意事项
5、4个单位抗原配备一定要准确，如果配备的抗原效价高，那么抗体滴 度就会低，反之抗体滴度会高，一般现用现配 。回归试验来判定效价测定的 正确与否。做法：做四排，每排的1-4孔加入生理盐水50UL，取配好的四个单 位抗原50UL与第一孔做倍比稀释至最后一孔并弃掉50UL，最后每孔加入 50UL红细胞悬液，震荡，静置20分钟观察结果。如果第一和第二孔完全凝集 不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，则说明四个单位抗原配制正确。 6、红细胞悬液在洗涤的过程中一定要把白细胞膜吸取干净，颜色为鲜红 色，如果是暗红色很有可能发生了溶血。如果采集的红细胞免疫过禽流感， 那么可以多洗涤几遍。红细胞悬液一般情况下可以存放3天，如果要保持一周 左右就要在无菌情况下存放在阿氏保护液中。