基因工程实验设计

基因工程实验设计
一、目的基因的获取
ACCACCTTCATATGAAGAAATTAACGGTGTTTTCATGAGGAATCCAACAGTCGCTGAATTGGTGGAAAC TGTGGAATTCTTCTTGGCTGAGGTAACCAATCATCACTTCACCACAATGCACAAGTTTGTAGCTTACTA CTACAGTACTTCTAATAAGTTTTGTCTGTTGAGATTTTATTGCTGATTTCTATGCATGGTCATCTTTTT GACAGGCCATCCAGTCTTATCGTGCTGAGAGTGAAACTGAGCTCAACCTGGCAGCTGGTGACTATATAG TTGTCCGGAAGGTACGGCCCTATCTTCCCATTGGACATGTTTCTAACCATAAACATATCTTTGCTGGAC TTTTGTGGGCAAAGTTGGCTACACTAAACTTGTGTTCATTAACCTGCTCAATCAGGTGTCAAACAATGG ATGGGCAGAAGGTGAATGCAGAGGGAAAGCTGGCTGGTTCCCTTACGACTACATCGAGAAAAGGGACCG TGTGCTTGCAAGTAAAGTCGCCCAGGTCTTCTAGGCGTTCAATGAGCCATACATACATAACCCTGGTGT TGTACACTGTATTATGATCGTTCGTGATCTTCAAAGACCCTCTGATCAGAGAAATCACAAATATTCTTT TGTTCTATTATTGTCATTATCACTACCCCTTTTGTCAAAACCAGTGCAGCCTTTT
二、引物设计
正向引物：12 5’-CCC AAGCTT ACGAGGTT-3’53.6℃
反向引物：378 5’-CCG GAATTC TTATCATG-3’ 49.2℃
三、水稻总DNA提取
1、实验材料：水稻
2、实验仪器、器皿、试剂
仪器、器皿：研钵、离心管
试剂：研磨液：0.45mol/l NaCL 0.1mol/l Tris-CL(pH7.0)
0.1mol/l EDTA-Na2 1%SDS
70%乙醇、95%乙醇、氯仿-异戊醇（24：1）、5mol/l高氯酸钠、3mol/lNaAC TE:10mmol/l Tris -Cl(pH7.6) 1mmol/lEDTA-Na2(pH7.6)
RNase:10mg/ml
液氮
3、实验步骤
1）、称取水稻萌发幼芽材料10g，清洗干净，再用70%乙醇表面消毒晾干
2）、将材料放入研钵中加入适量的液氮捣碎材料并研磨至粉状
3）、加入20ml研磨液，继续研磨至糊状
4）、加入等体积的氯仿-异戊醇充分混匀，分装与离心管中
5)、4000g 10min，取上清液
6）、72℃水浴保温3—4min，加入5mol/l高氯酸钠（体积比4：1）
7)、加入的体积的氯仿-异戊醇（24：1）混匀，4000g离心10min
8)、加入2倍体积的95%低温乙醇，沉淀DNA，可见白色丝状物
9）、4000g离心10min,弃上清液，加入适量的TE溶解
10)、加入RNase至终浓度为50ug/ml,37℃保温30min
11)、加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），4000g离心10min
12）、吸取上层水相，加入1/10体积的3mol/lNaAC和两倍体积低温的95%乙醇，
混匀，在-20℃放置30min，DNA形成纤维状沉淀
13）、沉淀中加入1ml 70%乙醇洗涤一次，4000g离心8min去上清液，纸帕吸干
14）、DNA沉淀真空干燥后溶于TE中
四、强碱法提取PUC19质粒DNA
试剂：1、溶液1（GTE）：50mmol/l 葡萄糖、10mmol/l EDTA-Na2、25mmol/l Tris-Cl （pH8.0）、4mg/ml 溶菌酶
溶液2：200mmol/l NaoH、1%SDS
溶液3：5mol/l KAC 60ml、冰乙酸 11.5ml、ddH2O 28.5ml
2、苯酚-氯仿
3、异丙醇（或95%乙醇，100%乙醇）
4、70%乙醇
5、TE（pH8.0）：10mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、1mmol/l EDTA-Na2
6、RNase 1mg/ml 、Amp 100ug/ml
实验步骤
1、挑取一单菌落的Ecoli InvaF（PUC19）菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、吸1.4ml菌液至Ep管中，在高速台式离心机上5000r离心2min，倒去培养基。

3、重复一次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。

4、将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中，于离心机上5000r离心2min.
5、倒去溶液1，再悬于200ul冰冷的溶液1中。

6、加入300ul新配制的溶液2，冰浴5min。

7、加入300ul冰冷的溶液3，中和，轻轻振荡，至冰浴5min。

8、于离心机上，10000r离心5min。

9、加入等体积的饱和酚快速抽提，10000r离心5min取上清液。

10、再加入等体积的氯仿抽提，10000r离心5min取上清液。

11、加入750ul异丙醇，沉淀质粒DNA，10000r离心10min。

12、倒去异丙醇，用70%乙醇洗涤沉淀，10000r离心5min。

13、置冰箱内开盖干燥，悬浮于40ul去离子水或TE中。

五、目的全长基因序列的扩增
材料、试剂：目的基因以10ug/ul溶解在去离子水中、寡核苷酸引物、
TaqDNA聚合酶及其最适缓冲液（10X）
15mM MgCl2
2mM dNTPs(pH7.0)
去离子水
PCR薄壁管
PCR仪
琼脂糖凝胶电泳装置
凝胶成像系统
实验步骤：
1、按以下比例和浓度在PCR反应管中按下列顺序配制反应体系：
去离子水 11ul
10XTapDNA聚合酶缓冲液 2ul
目的基因模板 1ul
正向引物 1ul（25pmol）
反向引物 1ul（25pmol）
dNTPs 1ul
MgCl2 2ul
Taq DNA聚合酶 1ul（1U）
总体积20ul，置于PCR仪中进行自动PCR
2、PCR仪的设置：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃
退火 54℃
延伸 72℃
最后延伸 72℃ 5min
3、电泳检查：
扩增结束后，在体系中直接加入4ul电泳载样缓冲液，在预加了EtBr的1.2%琼脂糖凝胶上点样电泳。

5V/cm电场强度电泳45min后，紫外线下观察凝胶，正确扩增反应可观察到一0.5kb分子带。

六、DNA的回收纯化
1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸净凝胶表面液体并切碎。

计
算凝胶重量（提前记录离心管的重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100ul）
2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合，直到凝胶块融化（约6-8min）
3、加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

当分离的DNA片段小于400bp是，需要再加入一个体积的异丙醇
4、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000g离心1min。

再取滤液于DNA制备管中同样条件离心后弃滤液
5、将制备管置回2ml离心管，加入500ulBufferW1,12000g离心30s，弃滤液
6、将制备管置回2ml离心管，加入700ulBufferW2,12000g离心30s，弃滤液。

以同样的方法在用700ulBufferW2洗涤一次12000g离心1min
7、将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min
8、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中。

开盖室温静置3分钟，在制备膜中央加入
25-30ul或去离子水，温室静置3分钟。

12000g离心1洗脱DNA，重复一次
七、酶切目的基因PCR产物和质粒DNA
试剂 XbaⅠ限制性内切酶、
KpnⅠ限制性内切酶
10×buffer：50mmol/l NaCl
10mmol/l Tris-Cl
10mmol/l MgCl2
1mmol/l DTT（二硫苏糖醇）
步骤：
1.将DNA样品1ug溶解在16ul重蒸水中
2.加入2ul 10×buffer
3.加入1-2U的限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ
4.混合反应液后稍离使液体聚集，置37℃温育1小时
5.终止反应加入0.5mol/l EDTA-Na2，至终浓度为10mol/l
6.进行电泳检查酶切结果
八、回收纯化载体和目的基因（采用酚仿抽提）
步骤：1、收集载体于EP离心管中，并加入等体积的苯酚，12000g离心10min
2、取上清液到新的EP离心管中，加入等体积氯仿，12000g离心10min
3、取上清液于新的EP管中，加入1/10体积的醋酸钠(3mol)和2倍体积的无
水乙醇
九、目的基因与载体PUC19的连接
将目的基因与载体PUC19片段连接重组(20ul体系)
Vector 4ul
目的基因 13.5ul
10×ligase buffer 2ul
T4 ligase 0.5ul
16℃-22℃连接过夜，去除后55℃-60℃灭活
十、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
1、实验材料：E.coli InvaF(受体) PUC19质粒DNA
2、实验仪器、器皿及试剂
仪器、器皿：平板、三角瓶、EP离心管
试剂：LB培养基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、Nacl 10g/l 、1L水、琼脂2%氨苄青霉素100mg/ml 、 0.1mol/lCaCl2溶液
X-gal 20mg/l(用甲酰胺溶液配制)使用浓度为40ug/ml
IPTG 20mg/l(用无菌水配制)使用浓度为40ug/ml
3、实验步骤
1、从甘油保存菌种中接种一环E.coli InvaF至LB平板上，37℃道指培养过夜
2、挑取2-3mm直径的单菌落接种至50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养4-6h(摇
床转速200r/min)当OD600为0.6左右即可
3、吸取1.4ml菌液至离心管，5000g 2min，弃上清液，并倒置于纸帕
4、重复步骤3一次
5、将细菌悬浮液于750ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴放置10min
6、5000g离心2min，收集细菌
7、将细菌重悬于200ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液冰浴放置30min
8、每管加入质粒DNA50ng/10ul，轻轻混匀冰浴放置20min，设计一不加质粒DNA
的对照
9、将管置于42℃水浴锅中2-3min,不要摇动
10、迅速转移至冰浴2min
11、加入700ulLB液体培养基，37℃培养45min，以便转化菌表达抗性
12、接种到含100ul/ml Amp的LB冷平板上
13、将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养过夜
14、确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子
15、蓝白斑的筛选，选取白班
十一、菌落PCR检测
1、PCR mix（PCR预混液）的制备
Taq buffer（10×）20 μL
dNTP（2.5 mmol/L） 5 μL
Primer Forward（50 mmol/L）10 μL
Primer Reverse（50 mmol/L）10 μL
ddH2O 147 μL
Taq（2U/μL）8 μL
total 200 μL
将上述溶液混匀，10μL每管分装于200μL PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，将平板上点的克隆标号与管子上的对应起来，以便筛选到克隆后进行扩繁培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。

PCR反应程序根据具体的引物设置，参考下列程序：
95℃，3 min
95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30个循环
72℃，10 min。

4、电泳检测是否得到目的片断，如有则为阳性克隆。

取5μL PCR反应液与1μL上样缓冲液混合，进行1%琼脂糖电泳，5V/cm，选择适当大小的DNA分子量标准，检查扩增产物。

5、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增，次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。