核酸分子杂交技术工程创建

2. DNA快速核酸标记
大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽 链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶 具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸 外 切 酶 活 性 ， 但 缺 乏 5’→3’ 核 酸 外 切 酶 活 性 。 利 用 Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹 陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’ 末 端 。 用 Klenow 片 段 标 记 末 端 一 般 只 用 一 种 [α-32P] dNTP，加入反应的[α-32P] dNTP取决于延伸的5’末端序 列。
同 时 根 据 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I 的 5’→3’ 核酸外切酶活性，此酶将缺口5’端 核苷酸依次切除，其结果是在缺口的5’端 不断消除核苷酸而在3’端则依次添加核苷 酸，从而使缺口沿着互补DNA链移动，故 称 缺 口 平 移 。 根 据 这 个 原 理 ， 用 α-32P dATP 置 换 先 前 存 在 的 核 苷 酸 ， 则 可 制 备 高活性的DNA探针，能满足大多数杂交的 要求。
尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个 杂交分子的稳定性影响很小。
二、核酸探针的种类
根据标记方法不同可分为： 放射性探针 非放射性探针
根据核酸的性质不同又可分为： DNA探针 单链(ssDNA) 双链(dsDNA) RNA探针 cDNA探针 cRNA探针 原 位 杂 交 可 分 为 DNA-DNA ， cDNA-RNA ， RNA-
目前非放射性标记物有以下几类：金属如Hg；荧光物 质如FITC；半抗原如地高辛（DIG）；生物素；酶类如辣 根过氧化物酶（HRP）；半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP） 等。
四、核酸探针标记及显示方法
（一）核酸探针的放射性标记技术 1. 缺口平移标记方法 （nick transcription）
原理：首先用DNA酶在双链DNA探针的一条链上制造一个缺口 （nick），缺口处形成3’-羟基末端，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化 下将核苷酸残基加在3’-羟基本上。
3. Fra Baidu bibliotekT4多核苷酸激酶标记DNA5’末端
寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此方法。 T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬 菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷 酸转移至DNA或RNA的5’-OH末端。在过量ADP存在时， 也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移 到5ADP上生成ATP，然后催化[α-32P] dNTP上的标记磷 酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并得 到标记。注意要用碱性磷酸酶去掉磷酸基团。
RNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式。
三、核酸探针的标记和检测
最早采用也是目前最常用的核酸标记方法是放射性同 位素标记，常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高， 信号强，最常用。放射性同位素探针虽然灵敏性高，但却 存在辐射危害和半衰期限制。由于存在上述缺点，近年来， 人们在寻求非放射性标记物方面取得了很大进展。国际上 已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒，在 国内也具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出 售。
由于这种技术具有高度的特异性和灵敏性，已广泛应 用于生物学、医学科学研究，临床传染病和遗传病的诊断。
一、核酸分子杂交的基本原理 从化学和生物学意义上理解，探针(Probe)是一种分
子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分 子反应。
抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、 受体-配体(ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分 子反应。
如果在底物中加入[α-32P] dNTP或其它标记的dNTP， 则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物掺入率 可高达70％-80％。PCR标记技术特别适用于大规模检测和 非放射性标记。该法的特点是要合成一对特异性PCR引物。
5. 聚合酶链反应
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种 分子生物学新技术，由于美国Cetus公司人类遗传学部的 Kary B. Mulli于1985年创立。该技术利用两个与相反链杂 交并随着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的 DNA片断，包括膜板变性、引物退火和引物延伸三个步骤 的反复循环，最终两引物所夹靶DNA得到千万倍以上的扩 增。可用来标记高比活性的DNA探针，PCR技术有很高的 特异性，可以在1-2小时内大量合成探针DNA片断。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术(Nucleic acid molecular hybridization)是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。
不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列， 即可按碱基配对规则以氢键相结合。通常是先对一种核酸 进行标记（如放射性同位素35S，32P或生物素等）作为探 针，去探测另一种核酸序列。核酸分子杂交可以在DNA与 DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行。
蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力 （疏水、离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合， 而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同， 通过氢键在几十、几百甚至上千位点上的结合。
核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可 能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。
标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12 ％的单个碱基被修饰的类似物取代。
4. 随机引物延伸标记方法
是从单链DNA或RNA模板合成高比活 性的32P标记探针所选用的方法。原理: 使 长 6-8nt 的 寡 核 苷 酸 片 段 与 变 性 的 DNA 或 RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下， 以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为 引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32P dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处 理后，新合成链（探针片段）与模板解离， 即得到无数各种大小的探针DNA。因为所 用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与 模板DNA随机发生退火反应，因此，被称 为随机引物(random primer)。这种随机引 物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。