卵母细胞的冷冻技术
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非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
⑵卵泡液对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的 影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养 2.卵母孤雌激活胚胎的培养 3.数据的统计与分析
三、实验
4.结果
本实验将检出的卵母细胞分别放到含有0，5，10，20％ bFF成熟培养液中。比较不同浓度的卵泡液对冷冻后牛卵母 细胞孤雌发育的影响，结果见表4。
四、卵母细胞冷冻的前景及展望
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
三、实验
4.2.本试验选用2种不同的冷冻保护剂，对比两种保护剂哪种更能有效 的保护牛卵母细胞。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
三、实验
3.卵母细胞解冻：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
随着胚胎移植、转基因动物、 核移植及体外受精等生物技术 的快速发展，卵母细胞供不应 求，急切需要能够保存卵母细 胞的新方法。现在小鼠成熟卵 母细胞冷冻保存技术时比较完 善的，而其他物种的冷冻保存 还需要很远的路要走，继续探 讨冷冻方法，冷冻剂等一系列 条件对卵母细胞冷 冻的影响。
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存 l周。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
⑵卵泡液对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的 影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养 2.卵母孤雌激活胚胎的培养 3.数据的统计与分析
三、实验
4.结果
本实验将检出的卵母细胞分别放到含有0，5，10，20％ bFF成熟培养液中。比较不同浓度的卵泡液对冷冻后牛卵母 细胞孤雌发育的影响，结果见表4。
四、卵母细胞冷冻的前景及展望
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
三、实验
4.2.本试验选用2种不同的冷冻保护剂，对比两种保护剂哪种更能有效 的保护牛卵母细胞。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
三、实验
3.卵母细胞解冻：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
随着胚胎移植、转基因动物、 核移植及体外受精等生物技术 的快速发展，卵母细胞供不应 求，急切需要能够保存卵母细 胞的新方法。现在小鼠成熟卵 母细胞冷冻保存技术时比较完 善的，而其他物种的冷冻保存 还需要很远的路要走，继续探 讨冷冻方法，冷冻剂等一系列 条件对卵母细胞冷 冻的影响。
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存 l周。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。