卵母细胞的冷冻技术
人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展
【 关键词 】 玻璃化冷冻 ； 卵细胞 ； 辅助生殖技术
卵母细胞冻存是辅助生育领域 的研究热点 之一 ， 冷冻技 术主要有程序化 冷冻及玻 璃化 冷冻 法。玻璃 化冷 冻是 一种
胞都有毒性 ， 若浓度过 高 ， 对保存 的细胞会 造成严重 的损伤 。 目前 ， 多数学 者认 为 乙二醇 （ Ｇ） Ｅ 加上 大分 子糖 类是 比较 理 想 的玻璃化溶液 的良好候选材料 。
快速冷冻技术 ， 冷冻 对象放 在冷 冻保护 剂 中 ， 细胞 脱水 将 待
及渗透性冷冻保护剂进入细胞且两者 达到平衡 后 ， 投入液 再 氮进行冷冻保存 。玻璃化冷冻可使细胞迅 速通过“ 险温度 危
２ 卵细胞玻璃化冷冻 不 同时期 的卵 细胞 对外 界环境 的敏感性 不尽 一致 。低 温会造成卵细胞透 明带 发生变 性 ， 降低 卵子 的受 精能力 ， 因 此卵子的冷冻保存成功率较低 。研究 表 明， 卵子 的玻璃化 冷 冻较常规 的程序化冷冻有较高 的存 活率和受精 率 ， 近年 来
变化小 ， 胞 可 以耐 受 ， 苏后 存 活率 及 妊 娠 率 均有 所 提 细 复
高＿ ｌ 。Ｃ ｅ ｈ ｎ等¨ 研究发 现采 用平 衡 液 的复苏后 存 活率 可
达 ９％ ， ３ 明显 高于不使用平衡 液预处 理的 ６ ％ 。同时采用单 ５
精子胞浆显微注 射 （Ｃ Ｉ 可弥 补透 明带 硬化 带来 的受 精 困 ＩＳ ） 难＿ ｌ 。可见 ， 玻璃化冷冻技术 的临 床应 用及 不断发 展 ， Ｍ 使 Ⅱ卵细胞冷冻后妊娠率及活产 出生率得到 明显提高 。
胞内冰晶的形成 ， 降低细胞损伤 ， 在人类配子、 胚胎的冷冻保存 中取 得了不少进展 。近十几年 来 ， 玻璃化冷冻技 术已 成功应用于成熟卵母细胞 、 未成熟卵母细胞等方面的冷冻保存并取得成功。该技术操作简单 、 迅速快捷 ， 正逐渐成为
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究的开题报告
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研
究的开题报告
一、研究背景及意义
近年来，随着生殖技术的逐步发展和成熟，胚胎冷冻技术已经成为
了一种有效的保护和利用动物遗传资源的方法。
同时，该技术也被广泛
应用于人类的生殖医学领域，为不孕不育、遗传疾病等问题提供了可行
的解决方案。
在动物领域，奶牛是重要的经济动物之一，其肉、奶、皮毛等多个
产业都拥有广阔的市场。
而胚胎冷冻技术的应用不仅可以为奶牛的优良
种群提供保护，还可以实现对其生产效益的提高。
因此，奶牛胚胎冷冻
技术的研究具有重要的意义和应用价值。
二、研究内容及方法
1. 奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究
卵母细胞玻璃化冷冻是指将卵母细胞置于高浓度保护剂溶液中，使
其渐进性脱水并达到可逆的冷冻/解冻状态，从而实现卵母细胞的保存和
利用。
本研究将对奶牛卵母细胞冷冻的基本条件进行研究，并通过体外
培养和移植实验，测试不同奶牛卵母细胞冷冻方案的效果和适用范围。
2. 奶牛胚胎程序化冷冻技术的研究
程序化冷冻技术是指将胚胎在发育过程中特定阶段静止，并将其置
于保护剂溶液中进行快速冷冻和解冻，以保证胚胎的完整性和发育能力。
本研究将针对奶牛胚胎发育过程中的不同阶段，设计多种具有代表性的
程序化冷冻方案进行研究，并通过移植实验，比较其效果和适用范围。
三、研究预期及意义
通过本研究的开展，可为奶牛胚胎冷冻技术的应用提供更为科学和有效的方法和技术路线，进一步保护和利用奶牛的遗传资源，推动奶牛产业的可持续发展。
同时，该研究在探索动物胚胎冷冻技术的理论和实践方面也将为生殖医学领域的进一步发展提供参考和借鉴。
猪卵母细胞冷冻技术研究进展
（ 阳农业 大学 动 物 胚胎 工程 实验 室 ， 沈 辽宁 沈 阳 １ ０ ６ ） １ １ １
摘
要： 述 了猪 卵母 细胞 的冷冻 保 存方 法 和解 冻 方 法 ， 时对 保存 效 果 、 响保 存 的 因素 、 护剂 的选 择 等 进行 探讨 。 综 同 影 保
内的冷冻保护剂浓缩 ，在冷冻过 程 中形成胞 内玻
璃 化 而 不 形 成 冰 晶 ，因而 避 免 了 细 胞 内形 成 冰 晶 造成的化学和物理损伤 ， 卵母细胞得到保护 。 使 目
要 。而从屠宰场 回收废弃 卵巢加 以利用 以获取大 量卵母细胞 ， 可望成 为一条有效 的途 径【 动物 卵 ｌ １ 。
ｏ ｃ ｔ ｓ ｐ ｏ ｐ ｃｅ ｏ ｙｅ ｗａ ｒ ｓ ｅ ｔｄ． Ｋｅ ｒ ｓ： ｏ ｙ ； ｒ ｏ ｒ ｓ ｒ ａ ｉｎ； ｉ ｙ ｗｏ ｄ ｏ ｃ ￣ｓ ｃ ｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｏ ｐｇ
近 年 来 ， 随 着 动 物 胚 胎 生 物 技 术 的 迅 速 发 展 ， 卵 母 细 胞 的 需 求 日益 增 加 ， 通 过 回 收 体 对 仅 内成 熟 卵 母 细 胞 已 经 无 法 满 足 科 研 和 生 产 的 需
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｅ ｃ ｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｎ ａ ｄ ｔ ａ ｉ ｇ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｏ ｃ ｎ ｏ ｙｅ ｅ ｅ ｒ ｖｅ ｄ ｈ ｆ ｃ ｎ ｎ ｌ ｅ ｃ ａ ｔｒ ｒ ｓ ｒ ａ ｓｒ ｃ ： ｈ ｒ ｏ ｒ ｓ ｒ ａｉ ｎ ｈ ｗ ｎ ｔ ｏ ｆ ｐ ｒ ｉ ｅ ｏ ｃ ｔ ｓ ｗ ｒ ｅ ｉｗｅ ．Ｔ ｅ ｅｆ ｔａ ｄ ｉ ｆ ｎ ｅ ｆ ｃｏ ｓ ｏ ｐ ｅ ｅ ｖ － ｏ ｅ ｕ ｆ ｔ ｎ ｃ ｏ ｓｎ ｒ ｔｃ ｉｎ ａ ｅ ｔ ｎ Ｏ ｏ ｅ ｅ ａｓ ｉｃ ｓ ｅ ．Ａｔｌ ｓ，ｔ ｅ ａ ｐ ｉａ ｉｎ ｆ ｒ ｇ ｏ ｎ ｆｆ ｅ ｉ ｇ ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｏ ｃ ｎ ｉ ， ｈ ｏ ｉ ｇ ｐ ｏｅ ｔ ｇ ｎ ｓ ａ ｄ Ｓ ｎ ｗ ｒ ｌｏ ｄ ｓ ｕ ｓ ｄ ｏ ｏ ａ ｔ ｈ ｐ ｌ ｔ ｏ ｅ ｒ ｕ ｄ ｏ ｅ ｚｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｐ ｒ ｉ ｅ ｃ ｏ ｒ ｆ
卵母细胞的冷冻技术概要
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
山羊卵母细胞冷冻保存的研究进展
摘要： 卵母 细胞 的冷 冻保存 在胚 胎 工程技 术方 面有 重要 意义 。主要 概述 了山羊 卵泡 卵母 细胞 和腔 前 卵泡 冷冻保 存的研
究进 展 ． 以期 为后 续研 究 工作提供 参 考 。
关键词 ： 山羊 卵 母 细 胞 ； 前 卵泡 ； 冻 保存 腔 冷
中图分类号 ： ２４ Ｑ ７
Ｙ ｏ ｇ ｓｅ ｇ Ｌ ＯＸ ａ —ｏ ｇ ＰＡ ｉｇ ｌ ＵＹ ｎ －ｈ ｎ ， Ｕ ｉｏ ｔｎ ，Ｉ Ｏ Ｑｎ —ｉ ｎ
（ｒｎｈｏ ｎｍａ Ｈ ｓａｄｙＪｉ ｃｄ ｍ ｇ ｃ ｌ ｒｌ ｃ ｎｅ ， ｏ ｇｈ ｌ ｇ １６ ０ ，ｈｎ ） Ｂａ ｃ ｆ ｉ ｌ ｕｂ ｎ ｒ，ｉｎＡ ａ ｅ ｙ ｆ ｒ ｕｔ ａＳ ｉ ｃｓＧ ｎｚｕｉ １０ Ｃ ｉａ Ａ ｌ ｏＡ ｉ ｕ ｅ ｎ ３
低 温ｆ 液氮 一 ９ 液 氦一 ６ ） 境 下 ， 细胞 代 谢完 全停 １６ｏ Ｃ， ２ ９ｏ 环 ｃ 使
止． 升温 后细 胞又 恢复 活性 ， 而达 到长 期保存 的 目的 。 从
ｏ ｃ ｔ ｓ ｎ ｒ ａ ￣ ｌ ｏ ｌ ｌ ｓ ｒ ｕ ｏ ｙ ｅ ｄｐ ｅ ｎ ａ ｌ ｃｅ ｅｓ ｍｍａｉｅ ｗ ｉｈ ｗｏ ｌ ｒ ｖ ｄ ｅｅ ｅ ｃ ｒ ｈ ￣ｈ ｒ ｅ ｅ ｒ ｈ ｓ ａ ｆ ｉ ｗｅ ｒ ｄ， ｈ ｃ ｕ ｄ ｐ ｏ ｉ ｅｒ ｆｒ ｎ ｅｆ ｅｆ ｚ ｏ ｔ ｕ ｅ ｓａｃ ｅ． ｒ
冷 冻保 存 ， 可对 其 随 时利 用 ， 于试 验 研究 ， 适 于冷 冻 生 便 并 物 学及 受精 生物学 的基 础研 究 。 对优 良畜 禽 、 稀濒 危野 生 珍 动物， 可采用 卵母 细胞 冷 冻保 存 、 子 的冷冻 保存 以及胚 胎 精 冷 冻保存 联合 应用 ， 立 动物 种质 资 源库 ， 证种 质 的长 期 建 保
山羊卵母细胞冷冻保存技术研究
ｗａ ．％， ．％ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｉ ｏ ￣ｅ ｆ ，ｈ ｔｒｔ ｎ ｒｔ ｓ２ ．％， ２０ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ Ｔ ｅ ｓ６３ ９ １ ｅ ｐ ｃｉ ｌ；ｎｏ ｃ ｓｏ ｈ ｔｅｍａｕａｉ ｅｗａ ０５ ３ ．％，ｅ ｐ ｃｉ ｌ． ｈ ｖ ９ ｏ ａ ｖ
ｆ｝ ｉ ａ ｉ ａ ｅ ｗａｓ５． ％ ，１ ７％ ， ｅ ｐ ｃ ｉｅｙ ｎ ｌ ｅｒｌ ｔ ｔ ｉ ｏｎ ｒ ｔ ｚ １ ０＿ ｒ ｓ ｅ ｔ ｌ；Ｉ ＶＭ ｃ ｔ ｓ，ｈ ｅ ｉｚ ｔ ａ ｅ ｗａｓ２１４％ ， ０． ｖ ｏｏ ｙ ｅ ｔ ｅ ｆ ｒ ｌ ａ ｉ ｒ ｔ ｔ ｉ ｏｎ ． ３ ３％，
中图 分 类号 ：￥ ２ ．５ ８７３ 文 献标 志 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１ ０ — ３ ９ ２ １ ）９ ０ ０ — ６ ０ ５ ９ ６ （ ０ ２０ — ０ ０ ０
Ｓｔｄ ｎ ｃｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｎ ｔ ｃ ｎ ｏ ｙ ｏ ｏ ｔｏ ｃ ｔ ｓｘ ａｎ ｇ Ｈ Ａ Ｇ ｕ ｙ ｏ ｒｏ ｒ ｓ ｒａ ｉ ｅ ｈ ｏｌｇ ｆｇ ａ ｏ ｙ ｅ ／ｕＤ ｎｉ ， Ｕ Ｎ ｏ ｎ
收 稿 日期 ：２ １－ ２ ２ ０ １ １－ ０
基金项 目： 农业部公益性行业 （ 奶山羊 ） 科研专项 （０ １３ ３ ） ２ １０ ０ ８ 作者简介 ：许丹 宁（９ ８ ） １７ 一 ，女 ，副教授 ，博士 ，研究 方向为动物 营养及生殖生理。Ｅ ｍ ｉ ｘ ａｎｎ ＠１６ ｃｒ — ａｌ ｄｎ ｉｇ ２ ．ｏ ： ｎ 通讯作者 ：田允波 ，教授 ，博士生导师 ， 研究方 向为动物生殖生理及繁殖生物技术 。Ｅ ｍ ｉ ｔ ｎ ｏ ２ ．ｏ — ａ ： ｕ ｂ＠１６ ｃｒ ］ｙ ｎ
小鼠卵母细胞冷冻保存技术研究进展
细胞能体外成熟 ， 但体外受精后仅 ９ ～１． ％发 状 态 ， ７３ 细胞将 不会 受到 损伤 。
． 育 到两 细胞 。１９ ９４年 ， 低 温冷 冻 保 存 小 鼠 Ｇ 期 １ ２ 解 冻对 细胞 的作 用 超 Ｖ
卵母 细胞 的研 究 取 得 了突 破 ， 获得 了后 代 。本 文 并
０ 剩 ０ 鼠卵母 细胞 ， 体外 受精 胚胎 移植 后产 仔率 达４ ． 。 温 度之 前失 去 ９ 的水分 ， 下 １ 的边界水 的结 ５８
与成熟 卵母 细胞 相 比， 成 熟 卵母 细 胞 的冷冻 更 为 冰 机率 可忽 略不 计 。冷 冻 过 程 中 ， 未 细胞 内形 成冰 晶 其关 键 是 冰 晶 的 大小 。 只要 不形 成 困难 。１ ９ 年 ， ｃｒｅｅ 等用不 同方法冷冻保存 是 不 可避免 的 ， ９０ Ｓ ｈｏｄ ｒ 而是维持在微 晶 小 鼠生发泡 期 （ ＧＶ） 的卵母 细胞 ， 冻后 大部分 卵母 对细胞造成物理性损害 的大冰晶， 解
解 冻速度 取 决 于冷 却 时 细 胞 内水 分 的含 量Ｌ 。 ６ ］
０ － ０℃之 间终 止 ， 细胞 将 从小 鼠卵母细 胞 的保 存 原 理 、 冻 保 护 剂 的作 用 如 果细 胞慢 速冷却 至 一３ ～－４ 冷 解 避免小 冰 机 理 、 冻方 法 的原 理及 卵母 细 胞 冷 冻保 存 方 法 等 内形 成一 定量 的冰 晶 ， 冻速度 必须 较快 ， 冷
起来 的另一项很有潜力 的繁殖技术Ｌ ， １ 能够为体外 内向细胞外渗透 ， ］ 并继续在细胞外结冰 ； 如果细胞被 受精 、 核移植 、 转基因动物研制等胚胎工程技术提供 冷却过慢 ， 大量水分由细胞 内流向细胞外 ， 降低了细
更方 便和 更多 的材料 来 源 。小 鼠是 现 阶段最 主要 的 胞 膜 内外 的化学 势能 ， 造成 细胞 内进行性 脱水 ， 因此 实验 动物 ， 对其 卵母 细胞 冷冻 保存 的研 究 开 始 于 ２ 细胞 内不 可能形 成 冰 晶。相 反 ， 果 细胞 被 冷却 得 ０ 如 世纪 ５ ０年代 ［ 。１７ 年 ， ｉｉｇ ａ 。首 次报 道 过 快 ， ９ ７ Ｗｈｔ ｎ ｈｍ［ ｔ ］ 细胞 内的水 分不 能及 时流 出 ， 达不 到细胞 内外
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识（2023年）摘要人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分。
由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，参考最新国际指南和共识，结合中国临床实践现状，经充分讨论后形成该共识，旨在加强玻璃化冷冻技术质量控制，进一步改善卵母细胞及胚胎冷冻结局，提升辅助生殖服务质量。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要环节。
相较于传统的程序化冷冻，玻璃化冷冻技术以其简单快速、不依赖昂贵设备，且复苏率极高的显著优点，在国内外各大生殖医学中心迅速普及推广，从而为人类生育力保存、胚胎植入前遗传学检测以及全胚冷冻策略的广泛临床应用，提供了必要的核心技术支持。
卵母细胞及胚胎的冷冻复苏结局受诸多因素影响，包括冷冻保护剂种类、样本平衡时间、降温/升温速率和冷冻载体类型等，造成各生殖中心间冷冻结局的差异。
有鉴于此，参考最新指南和共识［1-7］，结合中国临床实践，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，组织本领域专家对人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻技术流程和细节进行归纳总结，以期提供一套全面系统的玻璃化冷冻操作规范指导意见，提升生殖医学中心服务质量。
一.人员资质培训初学者培训采用导师负责制，以经验丰富的胚胎学家作为指导老师，由指导老师依据质控指标和经验判断初学者达到标准后，方可进入下一阶段培训。
整个培训过程形成书面记录存档。
1.理论学习：初学者应理解玻璃化冷冻的基本原理，掌握冷冻保护剂浓度、操作温度、降温/升温速率等基本概念及控制方法［8］。
2.动物样本：建议初学者在指导老师监督下使用动物样本进行为期1~2个月的培训。
以小鼠8-细胞胚胎为样本不断练习冷冻和解冻操作，以熟练掌握试剂耗材的使用方法［8］。
鉴于小鼠胚胎对冷冻和解冻操作的敏感性低于人类胚胎［9］，建议对初学者的要求设为操作50例小鼠8-细胞胚胎的复苏率不低于同中心人类卵裂期胚胎（第3天）复苏率，且复苏后的小鼠8-细胞胚胎需继续培养24~48 h，其囊胚形成率应≥80%［10］。
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究的开题报告
水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究的开题报告前言水牛卵母细胞在畜牧业生产中具有重要意义，但其的保存和利用仍然存在许多难题。
冷冻保存是一种常用的保存方法，但卵母细胞的玻璃化冷冻技术还需要进一步研究和优化。
本研究旨在探究水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，为卵母细胞的长期保存提供技术支持。
一、研究背景水牛是我国重要的且具有特色的畜牧业生产动物之一，其卵母细胞的保存和利用对于水牛繁殖和生产具有重大意义。
然而，卵母细胞保存存在一些问题，如长期保存难度大、遇到琐碎问题较多、在冷冻及解冻过程中容易发生结晶等。
因此，为了提高卵母细胞保存效果及保存期限，需要对卵母细胞的冷冻保存技术进行进一步研究和改良。
二、研究目的本研究旨在探究水牛卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术，对玻璃化冷冻保存条件进行优化，为卵母细胞长期保存提供技术支持。
三、研究内容1.水牛卵母细胞的提取和培养2.卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及条件的确定3.卵母细胞玻璃化冷冻保存后的生存能力检测及效果评估四、研究意义水牛卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术研究可以延长细胞保存时间，提高细胞的存活率，使其更好地发挥繁殖生产的作用。
此外，本研究也将为其他动物卵母细胞的保存提供借鉴。
五、研究方案1.实验设计本研究采用完全随机设计，水牛卵母细胞将随机分配到试验组和对照组。
2.实验方法(1)水牛卵母细胞的提取和培养将5-6个月龄的水牛卵巢取出，利用体外切割法分离卵母细胞，分别在含葡萄糖的H-DMEM培养液中培养，并将培养皿放入恒温培养箱中，设置温度和气氛，如需添加生长因素，则在适当时候加入。
(2)卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及条件的确定在培养液中加入适当的保护剂，冷冻过程根据不同的温度和冷却速率确定。
冷冻完成后，将冷冻物样品放入液氮中进行保存。
同时，研究不同玻璃化冷冻保存条件对卵母细胞保存效果的影响，评价不同条件保存的卵母细胞的存活率和活性差异。
(3)卵母细胞玻璃化冷冻保存后的生存能力检测及效果评估在不同时间点(可设置为7、14、28天等时间点)分别取出冷冻保存后的卵母细胞，进行生存能力检测和效果评估，判断卵母细胞的存活率及生殖功能的影响程度，确定不同保存条件的存活率和效果差异。
哺乳动物卵母细胞冷冻保存技术研究进展
３ ． Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｈ ｕ ｓ ｂ ｎｄ ａ ｒ ｙ Ｍ ｎａ ａ ｇ ｅ ｍ ｅ ｎ ｔ Ｓ ｅ ｒ ｖ ｉ ｃ ｅ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｔ ｉ Ｚ ｏ ｎ ｅ ， Ｓ ｉ ｐ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｉ ｔ ｙ ， Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｓ ｉ ｐ ｉ ｎ ｇ １ ３ ６ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
３ ． 吉林省 四平市铁西 区畜牧管理服务 中心 ， 吉林 四平 １ ３ ６ ０ ０ ０ ）
摘要 ： 哺乳 动物卵母 细胞 冷冻保存 在种 质资源保存 、 胚胎工程技术和人类辅助生殖 方面具有重要 意义 。冷冻保存过 程所产生
的渗透压差导致卵母细胞体积迅速变化 ， 引起微结 构损伤甚 至死亡 。卵母 细胞冷 冻保存 过程 中的体 积调控成 为近 年来的研 究热点 。文章总结 了卵母细胞冷冻方法 、 冷 冻载体 、 抗冻保护剂的种类及卵母细胞体积 调控在细胞 冷冻保存过程 中的作用等
Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋｅ ｙ Ｉ ａ ｈ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ Ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ａ ｌ Ｅｃ ｏ ｎ ｏ ｉｃ ｍ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ， Ｃｈ ａ ｎ ｇ ｃ ｈ ｕ ｎ １ ３ ０１ １ ２， Ｃｈ ｉ ｎ ａ；
２ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｌｔ ｕ ｕ ｒ ａ ｌ ｃｉ Ｓ ｅ ｎ ｃ ｅ ｎｄ ａ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ １ ３ ２ １ ０ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读PPT课件
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究
邢 琼 曹云霞 章志国 魏兆莲 周 平 赵济华
摘 要 目的 ： 研究人类成熟卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液 ， 探讨人类卵母细胞玻璃化冷冻保存 的方法及临
床应用价值 。方法 ： 运用 ｃ ｏ ａ 进行人类成熟 卵母 细胞玻璃化冷冻保存 。 ｒ ｌｆ ｙｅ 复苏后行胞 浆内单精子注射一 胚胎移植或 培养至囊胚形成 ， 观察复苏后 卵母细胞受精及发育能力。 根据冷冻方法分为程序化冷冻组和玻璃化冷冻组 。 又将玻璃 化冷冻组分为 自配液冷冻组和成品液冷冻组 ， 比较各组存活率、 受精率 、 卵裂率及囊胚形成率。 结果： 程序化冷冻组和
ｗ ｒ ｙｐｅｅｖｄｕｉｇ ｒｏ ａ． ｅｕｃ ａ ｄｏｃｔｓ ｅｅ ｄ ｉｉｅｅ ｙ ｎ ａｙｏｌ ｍ ｃ ｐ ｒ ｉ ｅｔ ｎＯ ｓ）ｅ ｂｙ ｅｅ ｒｏｒｓｒ ｓ ｙｌ ｆＲ ｓｓｉ ｔ ｏｙｅ ｒ ｍｎｓ ｒｄ ｔ ｅｔｐ ｉ ｓｅｍ ｊｃ ｏ ｃ Ｉ ｍ ｒ ｅ ｅ ｎｃ ｅ ｔｅ ｗ ａ ｔ ｂ ｉｒ ｓ ａ ｎ ｉ ， ｏ
ａ ｄ ｔ ｖ ｓ ｇ ｔ ｅｆ ａ ｉ ｉ ｔ ｎ ｌ ｉ ａ ｐ ｌ ａｉｎ ｖ ｌ ｅ ｏ ｏ ｙｅ ｒ ｏ ｒｓ ｒ ａｉｎ Ｍ ｅｈｏ ｓ Ｈｕ ｎ ｔ ｒ ｏ ｙ ｅ ｎ ｉ ｅ ｔ ａ ｅｔ ｓ ｌ ｙ ａ ｄ ｃ ｎ ｃ ｌａ ｐ ｃ ｔ ａｕ ｆ ｃ ｔｓｃ ｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ． ｏｎ ｉ ｈ ｅ ｂ ｉ ｉ ｉ ｏ Ｏ ｏ ｔ ｄ ： ｍａ ｍａｕ ｅ ｏ ｃ ｔｓ
ｔ ｎ ｐ ａ ｔｔ ｎ ｏ ｕ ｔ ｒ ｄ ｔ ｌ ｓ ｌｔ ｎ ｏ ｓ ｒ ｉｇ ｔ ｅｆ ｒ ｌ ａ ｉｎ ａ ｄ ｄ ｖ ｌｐ ｎ ａ ａ ａ ｉ ｆ ｏ ｙｅ ． ｈ ｏ ｙｅ ｒ ｒ ｓ ｌ ｎａ ｏ ｒｃ ｌ ｅ ｂ ａ ｔ ａ ｉ ， ｂ ｅ ｖｎ ｅｔ ｉ ｔ ｎ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔｌｃ ｐ ｃｔ ｏ ｃ ｔ ｓ Ｔ ｅ ｏ ｃ ｔｓｗｅｅ ａ ｉ ｕ ｏ ｕ ｏ ｈ ｉｚ ｏ ｙ ｏ
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一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
⑵卵泡液对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的 影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养 2.卵母孤雌激活胚胎的培养 3.数据的统计与分析
三、实验
4.结果
本实验将检出的卵母细胞分别放到含有0，5，10，20％ bFF成熟培养液中。比较不同浓度的卵泡液对冷冻后牛卵母 细胞孤雌发育的影响，结果见表4。
四、卵母细胞冷冻的前景及展望
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
三、实验
4.2.本试验选用2种不同的冷冻保护剂，对比两种保护剂哪种更能有效 的保护牛卵母细胞。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
三、实验
3.卵母细胞解冻：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
随着胚胎移植、转基因动物、 核移植及体外受精等生物技术 的快速发展，卵母细胞供不应 求，急切需要能够保存卵母细 胞的新方法。现在小鼠成熟卵 母细胞冷冻保存技术时比较完 善的，而其他物种的冷冻保存 还需要很远的路要走，继续探 讨冷冻方法，冷冻剂等一系列 条件对卵母细胞冷 冻的影响。
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存 l周。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。