第二章(5)植物单细胞和原生质体培养技术

第二章（5）植物单细胞和原生质体培养技术
第一节植物单细胞培养技术
1 植物单细胞培养的意义
1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况；
1.2 有利于获得纯细胞系；
1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究；
1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。

2 植物单细胞的分离技术
2.1 从外植体直接分离单细胞
外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。

悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好。

2.2 从愈伤组织分离单细胞
将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。

为了增强分散
效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果胶粘连在一起的细胞分开。

2.3 通过原生质体再生法获得单细胞
外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。

3 植物单细胞的培养方法
3.1 平板培养法
3.1.1 单细胞悬浮液的制备
3.1.2单细胞悬浮液的密度调整
要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍
调整方法：①如果密度过大，加入液体培养基进行稀释；②如果密度小，通过低速离心使细胞沉降后，再加入适量液体培养基。

3.1.3固体培养基的配制
当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合成培养基。

当细胞植板密度过小，细胞对培养基的要求就变得越加复杂。

3.1.4单细胞悬浮液与固体培养基等量混合
①当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很薄一层(1mm)培养基中；
②在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。

3.1.5暗培养
注意：培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。

3.1.6继代培养
选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可以获得由单细胞形成的细胞系。

3.2 看护培养法
3.2.1将生长活跃的愈伤组织接种在固体培养基上;
3.2.2在愈伤组织块上方放置一片面积为1cm2的无菌滤纸，滤纸下方紧贴愈伤组织;
3.2.3借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液，然后接种在无菌滤纸上面。

3.2.4将在滤纸上由单细胞形成的细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。

3.3 微室培养法
3.3.1借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液，置于一张无菌载片上。

在这滴培养液四周与之隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的”围墙”，在围墙左右两侧再各加一滴石蜡油，每滴之上置一张盖片作为微室的“支柱”。

3.3.2单细胞悬浮液在微室中;
3.3.3将第三张盖片架在两个“支柱”之间，构成微室的“屋顶”;
3.3.4当细胞团长到一定大小时揭掉盖片，把细胞团转移到新鲜培养基上培养。

第二节植物原生质体培养技术
1 原生质体（Protoplast）
去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。

2植物原生质体培养的意义
在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。

但是有时候会存在有性不亲和。

如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。

高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。

原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。

3原生质体的分离
3.1材料来源
植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。

由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。

3.2前处理
要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。

为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。

或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好；或用金刚砂摩擦叶的下表皮。

3.3 提取方法
3.3.1机械分离法（Machanical isolation）
优点：（1）能排除酶的有害影响；
缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大。

3.3.2酶法分离（Enzymatic isolation）
注意事项：
⑴酶溶剂及其渗透压
酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制，
渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450～800mmol/L。

⑵酶处理：酶浓度；酶解时间；酶解温度。

4 原生质体的纯化
材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。

此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。

4.1 离心沉淀法
原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。

步骤：
第一步原生质体溶液用400目网筛过滤；
第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）；
第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。

如此2～3次；
第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。

4.2漂浮法
原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。

离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。

4.3界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。

5 原生质体活力检测
5.1 形态识别
形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。

5.2 细胞染色
FDA法：FDA(二乙酸荧光素)是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。

伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。

6 原生质体培养方法
6.1液体浅层培养
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。

缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。

此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

6.2液体－固体双层培养
优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

缺点：不易观察细胞的发育过程。

6.3固体平板培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。

缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。

6.4琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。

培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。

这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。

7 原生质体发育和植株再生
7.1细胞壁的再生
原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。

电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。

7.2细胞分裂和生长
一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、
分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。

一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。

7.3愈伤组织形成
通常原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞团，约6周后形成直径1mm的小愈伤组织。

原生质体培养7～10d后需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。

待小愈伤组织长至约1mm时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。

7.4 植株再生
原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。

但越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。

即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。

小结：本节主要讲述如何进行植物原生质体的分离和培养，要求学生详细的掌握植物原生质体的培养条件，了解通过植物原生质体再生植株的意义。

思考题：
1 植物单细胞和原生质体培养的意义
2 植物单细胞培养的方法
3 植物原生质体培养的方法。