1、肌原纤维蛋白的提取

1、肌原纤维蛋白的提取

肉样品，用5倍的提取缓冲液（0.1M NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0）匀浆后离心（2000 g，10min），重复四次并在第四次离心前用四层纱布过滤并用0.1M的Hcl将pH调至6.0，最后得到的蛋白膏保存于冰盒中备用。蛋白浓度用双缩脲法测定。

2、蛋白氧化模型的制作

构建以下氧化体系：反应历程为Vc+Fe3+→Fe2+，Fe2++H2O2→⋅OH，FeCl3浓度为0.01mmol/L，抗坏血酸浓度为0.1mmol/L，H2O2浓度分别为0.5、1、5、10、20 mmol/L。肌原纤维蛋白分散于上述氧化体系中（最终质量浓度为40 mg/mL），在4℃条件下氧化24h后用1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA ）EDTA ）终止。以上的氧化反应均在15 mmol/L 哌嗪-N,N’-双（2-乙磺酸）（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）0.6 mol/L的Nacl为缓冲溶液（pH 值 6.0）中进行。空白对照为新鲜猪背最长肌中提取出来后，未加氧化剂直接于4℃放置24 h 的肌原纤维蛋白（在本试验中将H2O2 浓度定义为0）。

3、羰基值的检测

在1.5 mL的离心管中，加入0.1 mL的蛋白溶液与0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl 溶液，在25℃下反应40 min，空白样品中不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/LHCl。然后加入0.5 mL 质量分数为20%的三氯乙酸（trichloroacetic acid, TCA），震荡后离心（11 000×g，5 min）弃上清，蛋白沉淀用2 mL 的乙醇-乙酸乙酯溶液（体积比为1:1）离心（11 000×g，5 min）洗涤3 次，挥发完溶剂后将蛋白质悬浮于1 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液（用0.1M Hcl调节pH至2.3）中，在37℃条件下水浴保温30 min。以空白为对照370 nm下测吸光值，蛋白质羰基衍生物的含量（nmol/mg•蛋白）使用摩尔吸光系数为22 000 L/(mol•cm)计算。蛋白浓度在溶解于盐酸胍后再次检测。