尼龙毛法分离T细胞
分离cd8t细胞基本流程
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尼龙毛柱分离细胞操作步骤
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You are able to use Nylon Fiber ColumnT (147-06721) when you separete T cells of mouse lymphocytes.
Procedure
1. Sample Cell suspension containing 2 4 108 cells/mL prepared from rat spleens; usually contains T cells at 30-35% and B cells at 55-65%.
2. Procedure
Step 1 : Washing Nylon Fiber Column T (L-Type)
Washing the column with 20 mL MEM, warmed at 37 in order to equilibrate Nylon Fiber with the buffer while removing air pokets foam the fiber bed.
MEM 5% FCS, 37 20mL
3. Determination of B cell Contamination Assess B cell contamination in obtained T cell suspention by immunofluorescence staining of the cell using Anti Rat Ig, Goat as the primary antibody and fluorescein-labeled Anti Goat Ig.
T细胞分离
T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。
粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。
有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。
粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。
葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。
E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。
尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。
一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。
目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。
ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
t细胞分离方法和分离原理
t细胞分离方法和分离原理（最新版4篇）目录（篇1）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的常用方法3.T 细胞分离的原理4.T 细胞分离的应用5.总结正文（篇1）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中扮演着关键的角色。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病的免疫机制具有重要意义。
一、T 细胞的概述T 细胞，即 T 淋巴细胞，是一种重要的免疫细胞，主要参与细胞免疫应答。
根据功能和表型的不同，T 细胞可分为多种亚型，如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ CD25+调节性 T 细胞等。
二、T 细胞分离的常用方法目前，常用的 T 细胞分离方法主要有以下几种：1.贴壁粘附法：利用 T 细胞与特定抗原结合的能力，使 T 细胞粘附在固相载体上，从而与其他细胞分离。
2.磁珠法：通过连接有磁珠的特异性单抗与 T 细胞表面抗原结合，在外加磁场中，利用磁珠与细胞间的相互作用力，实现 T 细胞的分离。
3.流式细胞术：利用 T 细胞表面特异性抗原与荧光标记的抗体结合，通过流式细胞仪对细胞进行分选。
4.尼龙毛柱分离法：利用尼龙毛对 T 细胞的吸附能力，与其他细胞进行分离。
三、T 细胞分离的原理T 细胞分离的原理主要基于其表面抗原与特定抗体或物质的特异性结合。
通过这种结合，可以利用外力（如磁场、离心力等）使 T 细胞与其他细胞分离。
目录（篇2）1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的必要性3.T 细胞分离的方法a.免疫磁珠法b.尼龙毛柱分离法c.贴壁粘附法d.Percoll 分层液法4.T 细胞分离的原理a.免疫磁珠法的原理b.尼龙毛柱分离法的原理c.贴壁粘附法的原理d.Percoll 分层液法的原理5.T 细胞分离的应用6.总结正文（篇2）T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型，它在免疫应答中起着关键作用。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍 T 细胞分离的方法和分离原理。
T细胞和B细胞鉴别
E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。
浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。
操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5—6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1—2h。
用预温的含10%—20%小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。
再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。
如此得到的T细胞纯度在90%以上，B细胞纯度可达80%。
亲和板结合分离法利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。
同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。
淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法适用。
荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。
其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。
E花环形成试验E花环形成试验-简介E花环形成试验是指通过花环形成检查T细胞的方法。
T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。
已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。
利用尼龙毛柱法分离野生型小鼠脾脏T细胞
利用尼龙毛柱法分离野生型小鼠脾脏T细胞：1, 取脾脏，冰上剪碎研磨，PBS冲洗2，吸取冲洗液,离心1000r5min，去上清重悬1ml 3，裂红：1乘裂红液（10：1）加入细胞悬液中，室温10分钟，离心去上清，重悬5ml4，尼龙毛柱：取1.5g尼龙毛装入20ml注射器内，填料的体积控制在15毫升左右,加入含血清培养基37度孵育一小时，打开液体流出后夹闭，加细胞悬液,加培养基，37度一小时，打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min，收集20ml左右，pbs冲洗，重悬，加标记原代T细胞分离（1）单个核细胞分离1）切取新鲜的人或小鼠肿瘤组织浸入磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)中，并记录肿瘤组织的体积。
2）随后，将组织剪碎并研磨通过100 µm孔径的细胞筛网(BD Biosciences)进入50 ml Falcon(BD)离心管。
3）同时，收集10ml HCC病人或健康志愿者的外周血，使用红细胞裂解缓冲液(BioLegend)将红细胞裂解清除。
4）在上述两组单细胞悬液中缓慢加入Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(GE Healthcare)，置入20°C的离心机中，以400×g的转速离心30m in。
离心结束自然减速，即加速度为零。
5）根据产品制造商提供的操作说明小心地吸取被淋巴细胞分离液分隔开的单个核细胞层。
脾脏T细胞分离只需过筛、裂红即可进入下一步骤。
（2）T细胞分离（尼龙毛柱法）1）在无菌生物安全柜中关闭尼龙毛柱(Polysciences)下端滤过孔，垂直固定，加入大量PBS平衡柱子。
2）打开尼龙毛柱滤过开关，调节流速控制在3~4ml/min，下接50 ml Falcon(BD)离心管。
3）加入3~4倍柱体体积预热至37度的无血清培养基，随后加入相同体积预热的含血清1640培养基，最后等培养基液面填满尼龙毛时，关闭滤过开关。
T淋巴细胞分离技术
T淋巴细胞分离技术(免疫细胞的分离、纯化和鉴定)免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。
粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。
有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。
粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。
葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。
E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。
尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。
一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。
目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。
ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。
人外周血T淋巴细胞纯化方法的比较
人外周血T淋巴细胞纯化方法的比较顾晓;杨尚琪;唐孝达【期刊名称】《江苏临床医学杂志》【年(卷),期】2001(5)1【摘要】目的 :探讨纯化外周血T淋巴细胞的 3种方法及其特点。
方法 :分别应用尼龙毛法、补体细胞毒法和免疫磁珠法分离健康人外周血。
结果 :尼龙毛法分离后T细胞纯度为( 70 7± 2 8) % ,明显高于分离前的( 5 5 6± 3 7) % (P <0 0 5 ) ;补体细胞毒法为( 82 8± 3 2 ) % ,显著高于尼龙毛法 (P <0 0 5 ) ;免疫磁珠法为 ( 96 0± 1 4) % ,最高纯度可达 98 1% ,显著高于尼龙毛法和补体细胞毒法 (P <0 0 5 )。
免疫磁珠法分离后T细胞的回收率为( 91 6± 6 8) % ,显著高于其它两种方法。
结论 :尼龙毛法和补体细胞毒法能够有效地初步分选T细胞。
免疫磁珠法是高效纯化T细胞的新方法。
【总页数】3页(P25-27)【关键词】淋巴细胞;纯化;免疫学;T淋巴细胞【作者】顾晓;杨尚琪;唐孝达【作者单位】上海市第一人民医院【正文语种】中文【中图分类】R392－33;R392.12【相关文献】1.人外周血NK细胞纯化方法的初步比较 [J], 徐彤;田志刚;张彩;张建华;夏青;孙汭2.人外周血NK细胞3种纯化方法的比较 [J], 张彩;田志刚;王郡甫;刘金生;张建华;许晓群;孙汭3.入外周血T淋巴细胞纯化方法的比较 [J], 顾晓;杨尚琪;唐孝达4.不同方法转染人外周血淋巴细胞效率比较 [J], 尹玲玲;阮素红;田宇;赵恺;徐开林5.估变的基础及方法研究部分：60Co—γ射线和B（a）P处理的人外周血T淋巴细胞HPPT基因位点突变频率的检测和比较 [J], 徐洪兰;曹毅;等因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CTLs治疗大鼠胶质瘤的实验研究
CTLs治疗大鼠胶质瘤的实验研究目的研究负载冻融抗原的树突状细胞（DCs）活化的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对胶质瘤大鼠的治疗作用。
方法分离培养SD大鼠骨髓来源的DCs并经C6细胞冻融抗原致敏，用负载抗原的DCs活化自体脾脏T淋巴细胞制成CTLs；制作大鼠胶质瘤模型10只并随即分为实验组和对照组，实验组大鼠静脉注射含CTLs的PBS悬液，对照组大鼠静脉注射等体积的PBS；术后第21d进行MRI扫描测量肿瘤体积，并跟踪分析90天的生存情况，死亡的大鼠取脑组织做病理学检查。
结果实验组大鼠肿瘤体积为33.65（±10.72）mm3，中位生存期45±13.44天；对照组大鼠肿瘤体积58.71（±13.65）mm3，中位生存期34±4.74天；结论CTLs能抑制胶质瘤大鼠脑内瘤体的生长速度，并延长荷瘤大鼠生存期。
标签：脑胶质瘤；免疫治疗；细胞毒性T淋巴细胞胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，目前仍以手术治疗为主，术后联合放、化疗进行治疗，但是治疗效果不佳，肿瘤易复发[1]。
本实验对胶质瘤大鼠进行CTLs 过继治疗，希望寻求一种有效的免疫治疗方案。
1 实验材料1.1 胶质瘤细胞株和实验动物大鼠C6胶质瘤细胞株购自于中科院上海细胞所。
10只雄性SPF级SD大鼠（200-250g）购自广西医科大学动物实验中心。
1.2 主要试剂RPMI1640高糖培养基（Hyclone），双抗及胎牛血清（Hyclone），大鼠淋巴细胞分离液（天津TBD），IL-4、GM-CSF（PeproTech）水合氯醛（中国医药上海化学试剂公司）。
2 方法2.1 C6冻融抗原的制备收集对数期生长的C6细胞，用无血清的RPMI 1640培养液重悬，调整细胞密度为107个/ml，放入液氮10min后迅速转移到37℃水浴箱溶解完全，如此反复冻融4次。
将上述冻融悬液经0.22μm过滤后备用。
2.2 DCs的培养与致敏取2-3周龄的大鼠断颈处死，于75%的酒精溶液中浸泡5分钟。
T细胞分离
T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。
粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。
有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞〉树突状细胞二抗体产生细胞〉B淋巴细胞〉T淋巴细胞二红细胞。
粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。
葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。
E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。
尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。
一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC 外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。
目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation )，用此方法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%, B淋巴细胞占4〜10%。
ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077;分离小鼠单个核细胞时比重为1.080;分离大鼠单个核细胞时比重为1.084 〜1.087;分离马单个核细胞时比重为1.090。
项目十六 免疫细胞的分离
项目十六免疫细胞的分离一、抗凝血的制备【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。
实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。
【试剂和器材】1．试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。
2．器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。
【步骤和方法】1．肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。
实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。
2．EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。
配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。
用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。
EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。
3．脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。
4．Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。
【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。
【注意事项】1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。
2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。
常采用旋转混合的方法混匀。
3．抗凝血放4℃保存。
【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。
EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。
脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。
Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。
免疫磁珠及尼龙毛分离纯化T淋巴细胞的比较研究
免疫磁珠及尼龙毛分离纯化T淋巴细胞的比较研究季敬璋;吕建新【期刊名称】《温州医学院学报》【年(卷),期】2005(035)001【摘要】目的:探讨免疫磁珠及尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法及其特点.方法:用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,再分别以尼龙毛和免疫磁珠分离出T细胞,然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力,MTT 法检测细胞增殖性能.结果:免疫磁珠方法分离后T细胞的纯度显著高于尼龙毛分离方法(P＜0.05),而且回收率也大于尼龙毛分离方法(P＜0.001),但二种方法分离的T 细胞在细胞活力和增殖性能方面比较差异无显著性(P＞0.05).结论:在细胞生物学研究中,免疫磁珠分离法是有效分纯T细胞的较佳方法.【总页数】4页(P4-7)【作者】季敬璋;吕建新【作者单位】温州医学院,检验医学院暨生命科学学院,细胞与分子医学研究所,浙江,温州,325027;温州医学院,检验医学院暨生命科学学院,细胞与分子医学研究所,浙江,温州,325027【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.免疫磁珠法分离纯化人肾癌CD133+细胞实验研究 [J], 吴恭瑾;卢建忠;杨宁强;杨发英;岳中瑾2.免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的应用研究[J], 黄克力;王巍;谢波;朱平;卢聪;朱小兰;麦明杰;沈二霞;吴若彬;刘怀普;黄晶晶3.免疫磁珠法在分离纯化外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群中的应用 [J], 莫雪安;周礼圆;秦超;张德敏;赵伟金4.免疫磁珠法分离纯化乳鼠肾血管周细胞 [J], 王丽;马跃荣5.脱脂棉及尼龙棉柱分离纯化T淋巴细胞的比较研究 [J], 姜曼;许桂莲;黎万玲;周镜然;吴玉章因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
T淋巴细胞提取
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
T细胞及B细胞的分离
试验中常需要从淋巴细胞群中分别出单一的T细胞或B细胞，以便更深化地讨论T,B细胞的生物学特性和功能。
目前常用的分别办法有免疫磁珠分别法和免疫吸附法，近年来应用流式细胞仪可以分别出均质性的单一细胞类型或亚群。
（一）免疫磁珠法分别T细胞和B细胞【原理】用特异性抗T细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（i m m unom angnet i c bea d s)，这种免疫磁珠可于磁场中结合淋巴细胞悬液中的T细胞，而未结合的B细胞和其他细胞被洗脱下来。
免疫磁珠法分别细胞具有纯度高（普通为95％～99%）的特点。
其分别效果可媲美流式细胞仪，并具有比流式细胞仪分别术经济、便利省时、容易迅速等优点。
【材料】1．淋巴细胞悬液；2．磁性激活细胞分别器（MA CS)MA CS柱（C型，可结合2x108个细胞）；3．生物素标志的磁性微珠；4．生物素标志的抗CD4和抗CD8单克隆抗体及生物素标志的羊抗鼠I gG F(Fab)2;5.MA CS柱染色洗涤液、MA CS柱洗脱液（含1％牛血清清蛋白的PBS)和MA CS柱；FI TC标志的亲和素；6．培养液及试剂 RP M I1640细胞培养液，浸湿液（含10％牛血清清蛋白的PBS)。
【办法】1．新MA CS柱需高温高压灭菌，烘干后备用。
将C型MA CS柱内分离用10m l注射器在柱下三通阀门处加入10m l MA CS柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭柱下三道阀门备用。
2．淋巴细胞悬液（2x108/m l）离心（1500r/m i n,5分钟），重悬于0.15m l MA CS染色洗涤液中，加入生物素标志的CD4单抗和抗CD8单抗各25ul （比例为0.05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。
用MA CS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/m i n,5分钟），重悬于0.15m1 MA CS染色洗涤液中，加入50ul生物素标志的羊抗鼠I gG F (Fab')2（比例为0.05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。
脱脂棉替代尼龙毛分离T细胞用于免疫学实验教学的探讨
Ｔ细胞 ，使用流式细胞仪鉴定 细胞纯度 和 回收率 ，台盼蓝检测 细胞 活力 。脱脂 棉分离 Ｔ细胞
的纯度 、回收率 和存 活率 虽 然都 略 低 于尼 龙毛 分离 法 ，但两 者 比较 均 无 显 著性 差 异 （ Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） 。结果显示脱脂棉分 离 Ｔ细胞是一种 简易 、快速 、经济 、纯度较高和基本上不损 伤细胞
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姜 爱英 ，谢 克俭 ，蔡 强军
（ 温州医学院 医学检验诊断学实验教学 中心，浙江 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
摘 要 ：探讨脱 脂棉和尼龙毛分离纯化 外周 血 Ｔ淋 巴细胞 的方法 和特点 ，建 立脱脂 棉分 离 Ｔ
细胞 的方法。采用密度梯度离心法分离人外 周血单个 核细胞 ，分别 以脱脂 棉和尼 龙毛分 离 出
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T淋巴细胞的分离技术
T淋巴细胞的分离技术T淋巴细胞的分离技术（一）原理混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。
（二）材料及试剂1．尼龙毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。
（三）操作方法1．尼龙毛的清洗与干燥（1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g)放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
(2)冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。
（3）重复(1）、(2）步骤6次。
（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内.2．装尼龙毛柱（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。
（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠,以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积.(3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。
3．细胞分离（1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛,关上阀门。
(2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞／ml。
(3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。
盖上注射器，37℃温育45min至1h。
（4）打开下口，缓慢放流(1滴／min)，收集于离心管中。
（5）离心,即获所需的T淋巴细胞。
(6）关闭注射器下口，于注射器内加入0。
85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。
脱脂棉替代尼龙毛分离T细胞用于免疫学实验教学的探讨
脱脂棉替代尼龙毛分离T细胞用于免疫学实验教学的探讨姜爱英;谢克俭;蔡强军【摘要】探讨脱脂棉和尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法和特点,建立脱脂棉分离T细胞的方法.采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,分别以脱脂棉和尼龙毛分离出T细胞,使用流式细胞仪鉴定细胞纯度和回收率,台盼蓝检测细胞活力.脱脂棉分离T细胞的纯度、回收率和存活率虽然都略低于尼龙毛分离法,但两者比较均无显著性差异(p＞0.05).结果显示脱脂棉分离T细胞是一种简易、快速、经济、纯度较高和基本上不损伤细胞活性的方法,除了可以代替尼龙毛用于免疫学实验教学中,也可作为开放实验培养学生的创新能力.【期刊名称】《实验室科学》【年(卷),期】2013(016)002【总页数】3页(P13-15)【关键词】脱脂棉;尼龙棉;T细胞;实验教学【作者】姜爱英;谢克俭;蔡强军【作者单位】温州医学院医学检验诊断学实验教学中心,浙江温州 325035【正文语种】中文【中图分类】R392-33;R-331T细胞分离技术是细胞生物学和免疫学研究的重要手段之一［1］，毋庸置疑也是“免疫学技术”极为重要的实验教学项目。
由于免疫磁珠和流式细胞术分离 T细胞试剂耗材价格昂贵，代价较高［2－4］，在高等院校免疫学实验教学中难以实现。
而根据T细胞的非黏附性将其与其他细胞分离的尼龙毛分离技术［5］，因操作相对简便易行，无需特殊仪器而被广泛用于实验教学。
但尼龙毛来源也并不十分容易，进口材料价格又相对昂贵，再次使用前需重新回收处理，势必给高等院校的实验教学的顺利开展造成一定程度的困难。
因此，我们采用脱脂棉替代尼龙毛进行T淋巴细胞的黏附分离，探讨其分离T细胞的效果，建立脱脂棉柱纯化人外周血T 淋巴细胞的方法，同时也可作为综合性和设计性实验，以培养学生的科研创新能力。
1 材料和方法1.1 实验材料外周血由本实验教学中心健康体检正常的实验技术人员和学生提供;淋巴细胞分离液(Ficoll液比重1.077±0.002);RPMI 1640培养基(Gibco产品);小牛血清蛋白(FCS)。
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尼龙毛法分离T细胞
实验用具：尼龙毛（填于10ml注射器）、三通管、细胞过滤网（300目）、载玻片、锡纸、10ml注射器、1ml注射器、RIPM1640(-FBS)(+FBS)培养基、1xPBS
颈椎脱臼处死小鼠，取外周、颌下、肠系膜淋巴结及脾脏，放于预冷的1xPBS中，转到细胞房超净台内操作。
取10cm dish倒入少于15ml PBS，将脾脏和淋巴结转入，分别磨至只剩白色结缔组织。
将悬液转移到15ml离心管中，300g离心5min,弃上清。
提前将红细胞裂解液用0.22µm滤头过滤，在脾脏细胞沉淀中加入3ml 裂红液，淋巴结细胞视情况决定是否裂红，加入裂红液吹散细胞，3min 后加PBS补至15ml,300g离心5min,弃上清。
15mlPBS重悬细胞，取两张细胞过滤网制成漏斗将细胞过滤一遍,300g 5min离心。
预热的1640培养基加入尼龙毛柱，10ml注射器推下培液，使尼龙毛充分浸润。
（一只小鼠需要3ml装柱体积尼龙毛）在注射器下方装上三通管，调至关闭状态。
用2/3柱体积含有血清的1640培液将细胞重悬，计数后加入浸润培液的尼龙毛柱中，打开三通管使液面下降至于尼龙毛平齐，关闭三通，此时观察滴下培液的浑浊度同时将其上柱，盖上锡箔纸，37度培养箱孵育1h。
在三通管底部装上1ml注射器针头，打开三通管让液体以每秒一滴的
速度滴下，用一个柱体积预热的含血清1640培养基上柱，将T细胞洗脱下来进行计数。
进一步进行染色。