尼龙毛法分离T细胞

尼龙毛法分离T细胞

实验用具：尼龙毛（填于10ml注射器）、三通管、细胞过滤网（300目）、载玻片、锡纸、10ml注射器、1ml注射器、RIPM1640(-FBS)(+FBS)培养基、1xPBS

颈椎脱臼处死小鼠，取外周、颌下、肠系膜淋巴结及脾脏，放于预冷的1xPBS中，转到细胞房超净台内操作。

取10cm dish倒入少于15ml PBS，将脾脏和淋巴结转入，分别磨至只剩白色结缔组织。将悬液转移到15ml离心管中，300g离心5min,弃上清。

提前将红细胞裂解液用0.22µm滤头过滤，在脾脏细胞沉淀中加入3ml 裂红液，淋巴结细胞视情况决定是否裂红，加入裂红液吹散细胞，3min 后加PBS补至15ml,300g离心5min,弃上清。

15mlPBS重悬细胞，取两张细胞过滤网制成漏斗将细胞过滤一遍,300g 5min离心。

预热的1640培养基加入尼龙毛柱，10ml注射器推下培液，使尼龙毛充分浸润。（一只小鼠需要3ml装柱体积尼龙毛）在注射器下方装上三通管，调至关闭状态。

用2/3柱体积含有血清的1640培液将细胞重悬，计数后加入浸润培液的尼龙毛柱中，打开三通管使液面下降至于尼龙毛平齐，关闭三通，此时观察滴下培液的浑浊度同时将其上柱，盖上锡箔纸，37度培养箱孵育1h。

在三通管底部装上1ml注射器针头，打开三通管让液体以每秒一滴的

速度滴下，用一个柱体积预热的含血清1640培养基上柱，将T细胞洗脱下来进行计数。

进一步进行染色。