pEASY-Blunt Cloning Kit使用说明书

● 快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。
● 提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。
● 对照插入片段克隆效率可达85% 以上。
● 包含LacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基
上，可进行蓝白斑筛选。
PCR 产物的制备
(1) 引物要求：引物不能磷酸化。
(2) 酶的选择： Pfu系列的DNA 聚合酶。
M13F (10 μM)，M13R (10 μM)，Trans1-T1 Phage
Resistant Chemically Competent Cell。Expected PCR
product size： 700 bp。 产品说明 pEASY®- Blunt Cloning Vector 适用于平端克隆。
to 50 μl
Final Concentration as required 0.2 μM 1× 0.2 mM 2.5 units
Not applicable
PCR
94℃ 94℃ 50-60℃ 72℃ 72℃
2-5 min 30 sec 30 sec 1kb/min 10 min
30 cycles
本产品仅供研究，不用于临床诊断。
目录号：CB101 保存:Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent
Cell-70℃保存六个月，其它-20℃保存六个月。 试剂盒组成 pEASY®- Blunt Cloning Vector (10 ng/μl)，Control
Template (5 ng/μl)，Control Primers (10 μM)，
EcoR V
BstX I
Not I
Xho I
Nsi I Xba I
Apa I
CCC TT
AA GGG CAA TTC TGC AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT
GGG AA PCR Product TT CCC GTT AAG ACG TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA
TransGen Biotech
Phone: 010-51296890 Customer Service: 400-898-0321 E-mail : trans @
pEASY ®-Blunt Cloning Kit
使用前请务必仔细阅读说明书
（3）重组克隆呈现淡蓝色或“fish eye” 插入片段没有影响lacZ 基因读码框，或插入片段太小， 这种情况下菌落呈现淡蓝色,可以进行下游实验。
pEASY ®-Blunt （3929 bp）
LacZα fragment: bases 1-548
Multiple cloning site: bases 234-358 M13 reverse priming site: bases 205-221 T7 promoter priming site: bases 362-381 M13 forward priming site: bases 388-404 f1 origin: bases 546-983 Kanamycin resistance ORF: bases 1317-2111 Ampicillin resistance ORF: bases 2129-2989 pUC origin: bases 3134-3807
对照片段（700 bp）PCR 体系
Components Control Template Control Primers (10 μM) 10×Buffer (Buffer 含Mg2+) 2.5 mM dNTPs EasyPfu DNA Polymerase ddH2O
Volume 1 μl 1 μl 5 μl 4 μl 1 μl
T7 Promoter
M13 Forward Primer
TCG CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAC AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC
AGC GGG ATA TCA CTC AGC ATA ATG TTA AGT GAC CTG CAG CAA AAT GTT GCA GCA CTG ACC CTT TTG
射不仅容易使DNA发生突变，而且影响克隆效率。
TransGen Biotech
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克隆常见问题分析 （1）克隆效率低 影响克隆效率有许多因素，如扩增目的基因所用引 物，基因的结构，插入片段和载体的比例等。如发 现克隆效率低，尝试用下列方法提高克隆效率。
a. 纯化PCR 产物。 b. 如插入片段的浓度太低，增加插入片段的量。 c. 用新鲜的PCR 产物。 d. 扩增用平端的酶，如Pfu、Vent DNA Polymerase。 （2）PCR 鉴定重组子失败 当用PCR 方法鉴定重组子，没有得到目的扩增产物， 又没有载体自连，说明PCR 反应失败。重新优化PCR 反应条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定 包含重组子的克隆。
模板，用M13 正向引物和反向引物鉴定重组子。 (3) PCR 反应条件：94℃预变性10 分钟（裂解细胞，
失活核酸酶），94℃变性30 秒，55℃退火30 秒， 72℃延伸（ 根据片段的大小确定延伸时间）30 个循环，72℃后延伸10 分钟。确认包含重组子 的克隆，扩大培养，用M13 F，M13 R 引物测序。 (4) 若载体自连，通用引物扩增，自连带大小为200 bp。 限制性酶切分析阳性重组子 挑选白色克隆接种于LB/Amp+ 或 LB/Kan+ 的液体培养基 中，过夜培养。碱裂解法或用试剂盒小量提取质粒，选
(5) 待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μl 菌液铺板，培 养过夜（为得到较多克隆，4000 rpm 离心1 min， 弃掉部分上清，保留100-150 μl，轻弹悬浮菌体， 取全部菌液涂板，培养过夜）。
阳性重组子的鉴定和测序 PCR 方法鉴定阳性重组子 (1) 挑选白色克隆至10 μl 无菌水中，涡旋混合。 (2) 25 μl 反应体系中取1 μl 混合液用作PCR 反应的
4、最佳反应时间
① 片段大小为0.1-1 Kb（含1 Kb）：5-10 min
② 片段大小为 1-2 Kb（含2 Kb）： 10-15 min
③ 片段大小为 2-3 Kb（含3 Kb）： 15-20 min
*片段为胶回收产物，反应时间取最大值。 5、最佳反应温度：25℃
*若片段是高GC结构，可以37℃反应。 （推荐用PCR 仪控温） 转化 (1) 加连接产物于50 μl Trans1-T1感受态细胞中（在
1 μl
轻轻混合，室温 (20℃-37℃) 反应5分钟。反应结束后，
将离心管置于冰上。
注意:
1、最佳插入片段DNA量
载体与片段摩尔比=1：7
*可以粗略的按照“1 Kb 20 ng”的比例计算。
（如1 Kb加20 ng、1.5 Kb加30 ng等）
2、最佳载体使用量：1 μl
无菌水。
pEASY ®-Blunt
M13 Reverse Primer
Hind III
Kpn I
Sac I Bam H I Spe I
BstX I
CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG GAA TTG GTC CTT TGT CGA TAC TGG TAC TAA TGC TGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAC
感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，
冰浴20-30分钟。 (2) 42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。 (3) 加250 μl 平衡至室温的SOC/LB，200 转，37℃孵育1小时。 (4) 取8 μl，500 mM IPTG，40 μl，20 mg/ml X-gal混合，
均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30 分钟。
(3) 反应条件：为了保证扩增产物的完整性，扩增反应
需要5-10分钟后延伸。反应结束后，电泳检测PCR产物
的量和质量。
克隆反应体系的建立
在微型离心管中依次加入溶液：
PCR 产物
0.5-4 μl
（根据PCR 产物量可适当增减，最多不超过4 μl）
pEASY®- Blunt Cloning Vector
择适宜的限制性内切酶，酶切鉴定重组子。 测序 用M13 F，M13 R，T7 promoter 引物测序，进行序列分析。 注意事项 ● 根据PCR产物的强弱，增减PCR产物的量(0.5-4 μl)，
但是载体使用量不变。
● 反应时间绝对不能超过30分钟。 ● 总反应体积不能超过5 μl。 ● 随着克隆片段长度的增加(>3 kb)，克隆效率降低。 ● 若有引物二聚体，建议使用PCR纯化试剂盒；紫外照