第十五章DNA重组技术基本原理
重组DNA的基本原理
• 转基因作物的历史很短。1992年，中国种植了 世界上第一批商用转基因作 物－－转基因烟草。 1994年，美国市场上才首次出现了转基因食品， 一种软化 缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨 大优势，推广非常快。到2000年， 全世界已有 4420万公顷的土地种植转基因作物，其中美国 占68％，阿根廷占23％， 加拿大占7％，中国 占1％，其他国家占1％。大豆、玉米、棉花和 油菜是主要的 转基因作物，在美国，有近一半 的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是 转 基因作物。美国超级市场上的食物制品中， 约60％含有转基因的成分。在公众的 反对声中， 目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业 化国家，转基因作物的 种植面积有减少的趋向。 美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美 国是农产 品出口大国，欧洲、日本对转基因作 物进口的限制，也打击了美国农民的积极性。
Arguments on Human Cloning
A.人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出 賣？新的基因組合的專利是屬於科學家(醫生) 的，還是那個複製人的？如何保護專利權？ 如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來 複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷 偷用你的細胞複製人怎麼辦？
Arguments on Human Cloning Ethical Considerations
• 方式:
转化、转染、感染
导入大肠杆菌 1. 氯化钙转化法 2. 电击法 3. 体外包装感染法
• 导入哺乳动物细胞
• • • • • • • • • 1. 显微注射法 2. 电穿孔法 3. DNA-磷酸钙共沉淀 4. DEAE-葡聚糖转染法 5. 病毒感染法 6. 脂质体介导法 7. 细胞融合法 8. 原生质体融合法 9. 微细胞介导法
重组 DNA 技术的原理与实践
重组 DNA 技术的原理与实践DNA是生命的基础，它包含了构成生命体的遗传信息。
随着科技的不断发展，人们发现在实验室中可以进行DNA序列的重组，从而实现从一个物种到另一个物种基因的移植和修饰。
这就是著名的DNA重组技术。
本文将探讨重组DNA技术的实践和原理。
一、重组DNA技术的应用重组DNA技术在生物工程中广泛应用。
例如在农业上，利用这项技术可以创造出抗病、抗虫、耐旱、高产的新品种。
在医药领域，该技术被用于制药和基因治疗。
在生物科学中，该技术可以被用于制作背景DNA和构建载体。
二、DNA的切割重组DNA技术的原理是由DNA酶酶切、互补配对和连接酶的作用组成。
首先，DNA酶必须切开DNA分子。
DNA酶是一种类似于剪刀的酶，它可以识别和剪断DNA双螺旋结构中的磷酸骨架，从而产生自由的DNA末端。
接下来，一个非常重要的步骤是互补配对。
该步骤的目的是将两个不同的DNA分子相互配对。
配对后，两个不同的DNA分子中的合适的末端可以连接起来。
这个过程重在使两个分子在一个相对平等的水平上相互配对。
在配对之后，粘性末端酶可以用于连接两个DNA分子。
连接酶是一种酶，它可以解开和重建磷酸骨架，从而连接外源DNA和宿主DNA。
三、基因重组基因重组是将外源DNA导入到宿主DNA中的过程。
此过程可以培养在实验室中的细胞来完成。
首先，实验人员需要确保宿主细胞富含所需的酶和蛋白质，以支持外源DNA的插入。
接下来，DNA的切割和重组即可启动。
实际上，细胞可以直接接收重组DNA，这是因为DNA编码的基本构造在不同物种中非常相似。
因此，外源DNA通常可以自由地在宿主DNA中扩散并替换掉原来的DNA。
重组后的细胞可在实验室中培养。
如果外源DNA编码的蛋白质或酶能正常工作，则可以命名它为转基因细胞。
四、DNA重组技术的风险尽管DNA重组技术有着巨大的潜力和优势，但它也带来了一些风险。
一种潜在的风险是转基因组细胞可能会对环境产生不良影响，例如催化全球气候变暖或导致生态系统不稳定。
《DNA重组》课件
DNA重组技术展望
技术发展：未来DNA重组技术将更加精准、高效、安全
应用领域：DNA重组技术将在生物制药、基因编辑、生物合成等领域发挥重要作用
伦理问题：DNA重组技术可能引发伦理问题，需要加强监管和规范 技术挑战：DNA重组技术面临技术瓶颈和挑战，需要不断探索和创新
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汇报人：PPT
课程名称：《DNA重组》 课程目标：让学生了解DNA重组的基本原理和操作方法 课程内容：包括DNA重组的基本概念、原理、操作方法、应用领域等 课程对象：生物科学、生物技术、医学等相关专业的学生
课件目的
讲解DNA重组在生物技术中 的应用
介绍DNA重组的基本概念和 原理
探讨DNA重组在医学、农业 等领域的应用前景
04 DNA重组技术
重组DNA技术概述
基本原理：通过基因工程技术，将外源DNA片段插入到宿主细胞中，实现基因的转移和表达 应用领域：生物医药、农业、环境科学等领域 主要技术：基因克隆、基因表达、基因沉默等 安全性问题：需要考虑基因重组技术的安全性和伦理问题，确保技术的合理应用和健康发展。
制定伦理规范，明确重组DNA 的伦理边界
加强监管，确保重组DNA的合 规使用
加强公众教育，提高公众对重 组DNA的认知和接受度
07 总结与展望
DNA重组技术总结
技术原理：通过基因工程手段，将外源基因导入宿主细胞，实现基因的定向改造和表达 应用领域：生物医药、农业、环境等领域 技术挑战：基因导入效率、基因表达调控、生物安全性等 发展趋势：基因编辑技术、合成生物学、生物制造等
重组DNA技术应用
基因工程：通过重 组DNA技术，可 以改变生物的遗传 特性，如转基因作 物、基因编辑等。
生物制药：重组 DNA技术可以用 于生产生物药物， 如胰岛素、生长激 素等。
重组DNA技术ppt课件
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。
磷酸二酯键
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修
饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN带的所 有基因组DNA核苷酸序列不久即将完成。 但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。
重组DNA的基本原理
工业生物技术
重组DNA技术也可用于工业微生物的改造，如提高微生 物产物的产量、改进发酵工艺等，有助于推动工业生物技 术的发展。
06 重组DNA技术的安全性 与伦理问题
重组DNA技术的潜在风险与安全性问题
01
02
03
潜在健康风险
重组DNA技术涉及到改变 生物体的遗传物质，可能 对人类健康产生未知影响， 如基因突变、致癌等。
基因突变与诱变
通过DNA连接酶将突变引物连接到 目的基因上，实现基因的定点突变 或诱变。
05 重组DNA的转化与筛选
重组DNA的转化
转化过程
重组DNA的转化是将外源DNA导入受体细胞的过程，通 过转化，外源DNA可以整合到受体细胞的基因组中，实现 基因的转移和表达。
转化方法
常用的转化方法包括化学转化法、电穿孔法和显微注射法 等，不同的受体细胞和目的基因可选择适合的转化方法。
03
自此以后，重组DNA技术不断发展，成为现代生物技术领 域中应用最广泛的技术之一。
重组DNA技术的应用领域
基因治疗
利用重组DNA技术修复或替换 病变基因，治疗遗传性疾病和 某些癌症。
农业生物技术
通过重组DNA技术改良农作物 和家畜的性状，提高产量和抗 性。
基因工程
通过重组DNA技术将外源基因 导入细胞或生物体内，实现基 因的表达和产物的生产。
重组DNA转化在生物技术中的应用
基因工程
重组DNA技术是基因工程的核心技术之一，通过重组 DNA转化，可以实现基因的克隆、修饰、表达和调控， 为基因治疗、生物制药等领域提供技术支持。
细胞工程
重组DNA转化在细胞工程中也有广泛应用，如细胞株的 建立、细胞遗传改造和细胞分化调控等。
第15章 DNA重组技术 PPT课件
（三）体外重组：
1、粘性末端连接 2、平末端连接 3、粘平性末端连接 4、同聚物加尾连接
（四）重组DNA的导入：
1、转化： 质粒或其他导入原核细胞。 2、转染： 质粒导入真核细胞。 3、感染： 病毒导入宿主细胞。
（五）重组体的筛选：
遗传学方法：
抗药性标志筛选： 载体携带某种抗生素抗性基因，转化进
PCR：体外扩增DNA的方法。
以目的DNA分子为模板，以一对分别与该 DNA分子的5’端和3’端互补的寡核苷酸片段为 引物，以4种dNTP为原料，由DNA聚合酶沿 着模板延伸合成新的DNA。不断重复这一过 程，使目的DNA得以扩增。
贵阳医学院生物化学与分子生物学教研 室
（二）载体的选择：
目的不同，操作基因的性质不同，载 体的选择和改建方法也不同。
（五）工具酶：
工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶
功
能
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针
2、分类：
限制性核酸内切酶有三类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型），Ⅱ 型识别与切割的序列是有特殊结构的，是基因 工程中最重要的酶。
3、识别和切割位点：
Ⅱ型识别的序列是含有4~6个碱基对的反向对称 结构的DNA序列，称为回文序列。有两种切割方式， 分别产生黏性末端和平末端。
5’
GGATCC
Thank You!
二、疾病相关基因的发现：
生物医学的深入研究表明，人类的各种疾病都直接或间接与基 因有关。因此，可认为人类的一切疾病都是“基因病”。
第十五章基因工程_现代遗传学
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困 难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原 核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含 有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往 是没有活性的。 由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种 方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激 素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基 因，生长激素释放抑制激素基因等。 由于技术的进步，目前已极少利用化学合成 法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合 成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的 引物。
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker） 进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特 征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文 结构。如： BamH I 或Sau3A
Hpa II Hpa II
CCGGATCCGG GGCCTAGGCC
三、ＰＣＲ法：
PCR（polymerase chain reaction)技术是Mullis于 1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的 方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体 外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入 欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡 聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq） 以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92℃， 使模板变性。降温至约50℃使引物与模板结合（退 火），加温至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮ Ａ链延伸。重复92℃（变性）、50℃（复性）、 72℃（延伸）的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增， 可以重复几十个周期。ＤＮＡ片段将2n（ｎ为反应 周期数）的倍数增加。
一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）：
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
DNA重组实验原理及步骤
实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。
②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。
③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
*2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。
第十五章DNA重组技术的基本原理
第一节 DNA重组的技术要件
DNA重组技术：
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基 因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组 体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随 细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达 ，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状 。
（二）DNA连接酶
DNA连接酶（ligase）：能够催化两个DNA片段末 端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶。
（三）DNA聚合酶
（四）逆转录酶
（五）RNA聚合酶
二、目的基因的载体类型及其功能
载体（vector）: 能够携带外源基因进入受体细胞 的DNA分子。
基因克隆载体必备条件：（1）受体细胞本来就有 的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使外源 DNA片段插入的多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）；（3）能进行自我复制，具有复 制原点（ORI，origin ）；（4）具有选择标记， 承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛 选克隆子。
染的受体细胞的过程。 含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组
DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。
四、重组克隆的筛选方法 （一）利用载体的特殊标记进行筛选
（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采
用斑点杂交或DNA印迹(southern blotting)等方法进 行鉴定。 （1）斑点杂交法
基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重 组，获得具有高度应用价值的新物种。
为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离 用于克隆的此类基因，这样的基因通常列DNA片段，通 过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包 含某生物基因组全部DNA片段受体种
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
DNA重组技术
DNA的重组DNA Recombination一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用(conjugation)：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）,这种类型的DNA转移称为接合作用。
质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。
可接合质粒，如F 因子(F factor)（二）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA）应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程----实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。
目的：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)（二）工具酶•限制性核酸内切酶• DNA聚合酶I•逆转录酶• T4DNA 连接酶•碱性磷酸酶•末端转移酶• Taq DNA聚合酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
Ⅱ类酶识别序列特点—（三）目的基因（又称外源DNA）•cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。
第十五章 重组DNA技术
Blue-white screening on medium with ampicillin, X-gal and IPTG. white colonies contain recombinant plasmid and can be isolated directly from this plate
• DNA诊断 • 基因治疗
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DNA诊断 DNA Diagnosis
• DNA 诊断常用方法 PCR、限制性片断长度多态性、单链构象多 态性、限制性酶切图谱及基因测序等 • DNA诊断的应用 杜氏肌营养不良(DMD)、Leber遗传性神经 病、苯酮酸尿症
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基因治疗 Gene Therapy
• 基因治疗的概念 从基因水平调控细胞中缺陷基因、修补矫正 或替代缺陷基因，分为基因增补、替换、修 复三种类型。
14
质粒
• 细菌染色体外、自主复制、闭合环状 DNA • 分子量1kb到200kb以上 • 带有特殊的遗传信息 “抗药性”等 • 改造后成为极其常用的载体 穿梭载体
15
pUC19 map
16
第二节 重组DNA基本步骤
• • • • • 目的基因的获得(分) 载体的选择与修饰（切） DNA分子的体外重组（接） 重组DNA分子的导入、鉴定（转，筛） 目的基因的表达（表）
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目的基因的表达 Expressing a Target Gene
• 外源基因在原核细胞的表达 优点：简单、迅速、经济适合大规模生产 缺点：缺乏转录后、翻译后加工机制 • 目的基因在真核细胞的表达 表达产物更接近真核天然蛋白质结构 表达载体既含原核克隆载体的主要元件， 又含各种真核表达元件
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第三节 重组DNA技术在医学中的应用
重组dna的知识点总结
重组dna的知识点总结基本原理DNA重组是指将不同来源的DNA片段或基因进行重新组合，以产生新的组合，从而改变生物体的遗传信息。
其基本原理包括DNA分子的切割、粘合和表达等过程。
DNA的切割是指利用限制酶等酶类将DNA分子切割成特定的碱基序列，从而产生具有特定功能的DNA片段。
DNA的粘合是指将不同来源的DNA片段进行重组，形成新的DNA分子。
DNA的表达是指新的DNA分子在生物体内被转录和翻译为蛋白质，从而改变生物体的表型。
技术方法DNA重组技术主要包括PCR、基因克隆、蛋白质工程等多种方法。
其中，PCR是一种通过DNA聚合酶酶链反应合成特定DNA片段的方法，其主要原理是利用DNA聚合酶在特定温度下对DNA片段进行逐渐复制。
基因克隆是指将外源DNA片段插入到载体DNA上，从而形成新的DNA分子。
蛋白质工程是指通过改变DNA序列，从而改变蛋白质的结构和功能。
应用DNA重组技术在许多领域都有广泛的应用。
在医学研究领域，DNA重组技术可以用于治疗遗传疾病、疫苗研发、药物开发等方面。
在农业生产领域，DNA重组技术可以用于改良农作物、培育抗病虫害品种、提高作物产量等方面。
此外，DNA重组技术还可以用于环境保护、食品加工、工业生产等诸多领域。
风险尽管DNA重组技术在许多方面都有积极的应用，但其也存在一定的风险。
首先，DNA重组技术可能会导致新的疾病或致病变异的产生，从而对人类和环境造成危害。
其次，DNA重组技术可能会导致遗传物质的混合和扩散，从而对生物多样性和生态平衡造成影响。
因此，在应用DNA重组技术时需要严格遵守相关法规和伦理规范，确保其安全性和可持续性。
总结DNA重组技术是一种重要的生物技术，它可以改变生物体的遗传信息，为医学研究、农业生产等领域提供许多可能性。
其基本原理包括DNA分子的切割、粘合和表达等过程。
其技术方法包括PCR、基因克隆、蛋白质工程等多种方法。
其应用包括医学研究、农业生产、环境保护等多个领域。
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为此，必须从现有生物群体中，根据列DNA片段，通 过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包 含某生物基因组全部DNA片段受体(retro virus DNA) 构建重组DNA分 子用病毒包装物包装后 形成的减毒病毒感染患者 的细胞 将正常基因整合 到染色体上。
2000年法国 Fischer用基因工 程方法治愈患有 SCID（严重联合 免疫缺陷）遗传 病的两个婴儿(8 个月和11个月) 。 这一工作被认为 是20世纪人类基 因治疗上的重大 突破。
DNA重组的 技术路线
1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
Foreign DNA to be inserted
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
Introduction into host cells by transformation of viral infection
感受态细胞: 指处于能摄取外界DNA分子的生理状态 的细胞。
（一）重组DNA分子转化
大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。
转化（transformation） ： 携带目的基因的外源 DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其 中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。
转 化
（二）噬菌体重组体的转染 转染：通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感
PCR技术原理示意图
循环1 Tag酶
循环2
靶序列 变性和引 物复姓
链延伸
变性和引 物复姓
循环3
链延伸
二、目的DNA和载体的体外连接
目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的 基因的DNA片段组入合适的克隆载体。
三、将重组的DNA复合物导入受体细 胞
基因克隆的受体细胞：是能摄取外源DNA(基因)并使 其稳定维持的细胞。目前用作基因克隆受体的原 核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广 泛应用。
诱导植物产 生瘤细胞
第二节 DNA重组的基本技术步骤
1、目的基因的制备 2、目的基因与载体的重组 3、重组 体导入宿主细胞进行扩增 4、克隆基因的鉴定
Foreign DNA to be inserted
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
染的受体细胞的过程。 含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组
DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。
四、重组克隆的筛选方法 （一）利用载体的特殊标记进行筛选
（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采
用斑点杂交或DNA印迹(southern blotting)等方法进 行鉴定。 （1）斑点杂交法
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
一、重要的工具酶及其作用特点
一般把DNA 分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连 接等所用的酶称为工具酶。
（一）限制性内切酶
限制性内切酶（Restriction endonuclease）：是一类以环 状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中的特定核苷 酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二 酯键断开，产生３'-OH和5 ' -P基团DNA片段的内脱氧 核酸酶(endodeoxyribonuclease)。
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
一、目的基因的制备方法
1 PCR的原理：1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内 DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然 后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即 以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补 的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。 扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X--扩增效 率;n一循环次数。
基 因载体
mRNA
DNA
cDNA
甲基化，双链 接头DNA
部分或完全 酶解DNA
DNA长度分级
可克隆之DNA
DNA与载体连接
筛选出所需 要的克隆引入大肠杆菌 鉴定的滴度和特性扩增后供 长期储存
（三）人工合成DNA片段
（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA
第十五章 DNA重组技术 的基本原理
第一节 DNA重组的技术要件
DNA重组技术：
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基 因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组 体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随 细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达 ，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状 。
（二）DNA连接酶
DNA连接酶（ligase）：能够催化两个DNA片段末 端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶。
（三）DNA聚合酶
（四）逆转录酶
（五）RNA聚合酶
二、目的基因的载体类型及其功能
载体（vector）: 能够携带外源基因进入受体细胞 的DNA分子。
基因克隆载体必备条件：（1）受体细胞本来就有 的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使外源 DNA片段插入的多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）；（3）能进行自我复制，具有复 制原点（ORI，origin ）；（4）具有选择标记， 承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛 选克隆子。
对照
转基因抗棉 铃虫品种
受精卵细胞注射 转基因牛：受精卵注射法
转移有人类生长 激素转基因鼠
人类生长激 素转基因猪
四、遗传疾病诊断与基因治疗
利用基因诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从 DNA 即基因水平进行诊断 ， 准确度高，速度快。
如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。
特异基因导入并整合 到有遗传缺陷患者的基因 组中使疾病得到纠正或治 愈，通常叫做基因治疗 (gene therapy)。
提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在分 子杂交的膜上，用含目的基因DNA片段的探针与其 杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆 子。
（2）southern杂交法 斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中
含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染 色体基因组上还是其他基因组上。而southern杂交（DNA 印迹）则可对它进行定位。
（一）质粒及其功能
（二）噬菌体及其功能
（三）考斯质粒
（四）动物病毒的载体作用
（五）植物寄生菌作为目的DNA的载体
Ti质粒（Ti plasmid）：是一种细菌质粒，存在于土 壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens） （革兰氏阴菌） 细胞中，可诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )， 冠瘿瘤（grown gall tumors)。
（三）免疫学方法鉴定克隆
蛋白质印迹（western blotting）法：提取克隆子 总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子 大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与 放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性 抗体结合，通过抗原抗体反应，在杂交膜上显 示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目 的基因表达产物。
第三节DNA重组技术的应用前 景
基因工程应用大肠杆 菌生产人类生长激素
二、植物基因工程
转化基因植物是指将外 源基因转移到植物细胞内、 并整合到植物基因组中稳定 遗传和表达的过程。
许多植物基因已经被分 离、克隆。植物基因转化技 术也得到不断发展和完善。 应用最多的为农杆菌转化和 基因枪转化。
抗虫稻 对照