第十五章DNA重组技术基本原理

（三）免疫学方法鉴定克隆
蛋白质印迹（western blotting）法：提取克隆子 总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子 大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与 放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性 抗体结合，通过抗原抗体反应，在杂交膜上显 示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目 的基因表达产物。
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
一、目的基因的制备方法
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
一、重要的工具酶及其作用特点
一般把DNA 分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连 接等所用的酶称为工具酶。
（一）限制性内切酶
限制性内切酶（Restriction endonuclease）：是一类以环 状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中的特定核苷 酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二 酯键断开，产生３'-OH和5 ' -P基团DNA片段的内脱氧 核酸酶(endodeoxyribonuclease)。
诱导植物产 生瘤细胞
第二节 DNA重组的基本技术步骤
1、目的基因的制备 2、目的基因与载体的重组 3、重组 体导入宿主细胞进行扩增 4、克隆基因的鉴定
Foreign DNA to be inserted
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
对照
转基因抗棉 铃虫品种
受精卵细胞注射 转基因牛：受精卵注射法
转移有人类生长 激素转基因鼠
人类生长激 素转基因猪
四、遗传疾病诊断与基因治疗
利用基因诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从 DNA 即基因水平进行诊断 ， 准确度高，速度快。
如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。
特异基因导入并整合 到有遗传缺陷患者的基因 组中使疾病得到纠正或治 愈，通常叫做基因治疗 (gene therapy)。
1 PCR的原理：1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内 DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然 后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即 以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补 的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。 扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X--扩增效 率;n一循环次数。
基 因 组 文 库 建 立 顺 序
基因文库和cDNA文库的建立
组织
载体
mRNA
DNA
cDNA
甲基化，双链 接头DNA
部分或完全 酶解DNA
DNA长度分级
可克隆之DNA
DNA与载体连接
筛选出所需 要的克隆
引入大肠杆菌 鉴定文库的滴度和特性
扩增后供 长期储存
（三）人工合成DNA片段
（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA
感受态细胞: 指处于能摄取外界DNA分子的生理状态 的细胞。
（一）重组DNA分子转化
大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。
转化（transformation） ： 携带目的基因的外源 DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其 中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。
转 化
（二）噬菌体重组体的转染 转染：通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感
基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重 组，获得具有高度应用价值的新物种。
为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离 用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为目的基 因。
（一）建立DNA文库
某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通 过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包 含某生物基因组全部DNA片段受体菌群体（一套克 隆）称为这种生物的基因组文库。
第三节DNA重组技术的应用前 景
基因工程应用大肠杆 菌生产人类生长激素
二、植物基因工程
转化基因植物是指将外 源基因转移到植物细胞内、 并整合到植物基因组中稳定 遗传和表达的过程。
许多植物基因已经被分 离、克隆。植物基因转化技 术也得到不断发展和完善。 应用最多的为农杆菌转化和 基因枪转化。
抗虫稻 对照
第十五章 DNA重组技术 的基本原理
第一节 DNA重组的技术要件
DNA重组技术：
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基 因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组 体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随 细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达 ，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状 。
DNA重组的 技术路线
1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
Foreign DNA to be inserted
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
Introduction into host cells by transformation of viral infection
（一）质粒及其功能
（二）噬菌体及其功能
（三）考斯质粒
（四）动物病毒的载体作用
（五）植物寄生菌作为目的DNA的载体
Ti质粒（Ti plasmid）：是一种细菌质粒，存在于土 壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens） （革兰氏阴菌） 细胞中，可诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )， 冠瘿瘤（grown gall tumors)。
（二）DNA连接酶
DNA连接酶（ligase）：能够催化两个DNA片段末 端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶。
（三）DNA聚合酶
（四）逆转录酶
（五）RNA聚合酶
二、目的基因的载体类型及其功能
载体（vector）: 能够携带外源基因进入受体细胞 的DNA分子。
基因克隆载体必备条件：（1）受体细胞本来就有 的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使外源 DNA片段插入的多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）；（3）能进行自我复制，具有复 制原点（ORI，origin ）；（4）具有选择标记， 承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛 选克隆子。
染的受体细胞的过程。 含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组
DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。
四、重组克隆的筛选方法 （一）利用载体的特殊标记进行筛选
（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采
用斑点杂交或DNA印迹(southern blotting)等方法进 行鉴定。 （1）斑点杂交法
PCR技术原理示意图
பைடு நூலகம்循环1 Tag酶
循环2
靶序列 变性和引 物复姓
链延伸
变性和引 物复姓
循环3
链延伸
二、目的DNA和载体的体外连接
目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的 基因的DNA片段组入合适的克隆载体。
三、将重组的DNA复合物导入受体细 胞
基因克隆的受体细胞：是能摄取外源DNA(基因)并使 其稳定维持的细胞。目前用作基因克隆受体的原 核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广 泛应用。
方法：减毒的病毒 DNA作载体(retro virus DNA) 构建重组DNA分 子用病毒包装物包装后 形成的减毒病毒感染患者 的细胞 将正常基因整合 到染色体上。
2000年法国 Fischer用基因工 程方法治愈患有 SCID（严重联合 免疫缺陷）遗传 病的两个婴儿(8 个月和11个月) 。 这一工作被认为 是20世纪人类基 因治疗上的重大 突破。
提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在分 子杂交的膜上，用含目的基因DNA片段的探针与其 杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆 子。
（2）southern杂交法 斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中
含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染 色体基因组上还是其他基因组上。而southern杂交（DNA 印迹）则可对它进行定位。