血清学实验指导

实验目录

实验一：0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的制备

实验二：1%鸡红血球悬液的制备

实验三：禽流感血凝试验

实验四：禽流感血凝抑制试验

实验五：口蹄疫病毒3ABC-ELISA抗体检测技术实验六：猪瘟病毒ELISA抗体检测技术

实验一 0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液的制备

一、目的要求

掌握磷酸盐缓冲液的制备方法，为后续的血清学检测奠定基础。

二、药械及耗材

电子天平，小电炉，药匙，1000ml烧杯，玻棒，500ml三角瓶（带棉塞），pH试纸；

Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸馏水；1 N NaOH、1N HCl（滴管瓶塞）。

三、试验程序

配方：Na2HPO4.12H2O 2.9克

KH2PO4 0.3克

NaCl 8.0克

蒸馏水1000ml

将上述成分称量在烧杯中，加热搅拌溶解，待完全溶解以后，调整pH值至7.4。然后分装在3个三角瓶中（每瓶大约330ml），加棉塞，橡皮筋捆扎，置高压灭菌器中121℃15min灭菌处理，备用。

实验二 1％鸡红血球悬液的制备

一、目的要求

掌握鸡红血球悬液的制备方法，为后续的血凝和血凝抑制试验奠定基础。

二、药械与耗材

公鸡，玻璃注射器（30ml），16＃大针头，5％柠檬酸钠；800型离心机，玻璃离心管（10ml），洗耳球，10ml移液管，2ml移液管，棉花；0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液。

三、试验程序

※从心脏采集公鸡的抗凝血约25ml，平均分装3支离心管；

※作对称平衡以后，3000rpm离心10min，弃上清液，保留红血球泥；

※加入适量PBS，用乳头滴管轻轻地洗涤红血球，然后作对称平衡，3000rpm 离心10min，弃上清液，保留红血球泥；

※重复上述操作2～3次，直至上清液清亮透明；

※用10ml移液管轻轻地吸去上清液弃之，保留红血球泥；

※用10ml移液管向三角瓶中加入49.5mlPBS，再用2ml移液管吸取0.5ml 红血球泥，棉花擦去移液管外壁粘附的红血球。将0.5ml红血球泥放入

49.5mlPBS中，混匀置于4℃冰箱备用。

实验三禽流感血凝（HA）试验

一、目的要求

流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体结构，HA试验由此得名。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

二、药械与耗材

磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50μL移液枪、25μL 移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。

三、诊断试剂和待检样本

禽流感病毒血凝素分型抗原。

四、试验程序

※在微量反应板的1~12孔均加入25μL PBS，换滴头。

※吸取25μL病毒悬液加入第1孔，混匀。

※从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃去，换滴头。

※每孔再加入25μL PBS。

※每孔均加入25μL 1%鸡细胞悬液（注：勿必将红细胞悬液摇匀）。

※振荡混匀，在室温（20~25℃）下静置40分钟后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞将成为明显的钮扣状沉到孔底。

结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）

的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。以使红细胞100%凝集的抗原最高稀释倍数作为血凝效价。

实验四禽流感血凝抑制（HI）试验

一、目的要求

流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

二、药械与耗材

磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50ul移液枪、25ul 移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。

三、诊断试剂和待检样本

禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。

四、试验程序

根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4，即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。

※在微量反应板的1～11孔加入25ulPBS，第12孔加入50μL PBS。

※吸取25ul血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。

※1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温静置至少30分钟。

※每孔加入25μL 1%鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40分钟，对照红细胞将呈钮扣状沉于孔底。

结果判定：以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于22，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于判定HI试验阴性；HI价等于23为可疑需重复试验;HI

价大于或等于24为阳性。

实验五口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验

(NSP 3ABC-I-ELISA)

一、目的要求

口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病,传播迅速,可形成世界性大流行,对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群在采用疫苗的国家,大多数动物血清口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白和病毒相关抗原(VIAA,即3D)抗体均为阳性。因此,一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口蹄疫病毒感染与否。只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分，才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。目前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3BC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋白3ABC抗体。因此检测FMDV非结构蛋白3ABC 抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。

本试验采用FMD NSP 3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC 抗体。用于活畜进口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。

二、药械及耗材

2ml指弹头离心管，吸水纸，1～10ul移液枪，10～100ul移液枪,500ul移液枪，250ml烧杯，液体稀释槽，小、中、大移液枪尖。

三、诊断试剂和待检样本

3ABC-I-ELISA诊断试剂盒、待检血清样本。

四、试验程序

※将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做1：25倍稀释待