霍乱实验室检测
霍乱弧菌实验室检测ppt课件
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• 6.增菌培养6-8小时后，需要取胨水生长物再次观察动力 ，进行6-8小时动力报告。并转种到庆大霉素平板并放入 35℃孵箱中培养。在进行6-8小时动力报告时，需要先取 消之前的审核，在原报告单上进行审核（1505970005） 。
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0139霍乱弧菌，并认定为真正的霍乱弧菌。
三、不典型01群霍乱弧菌：可被多价01群血清所凝集，但该群 菌不产生肠毒素，因此无致病性
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霍乱病原学特点
• 形态与染色
– 弧状或逗点状 – 革兰染色阴性 – 有一根单鞭毛，细菌运动非常活泼，呈鱼群穿梭样或流星状
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霍乱实验室检测
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检验科
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霍乱病原菌发现
• 1883年德国科学家Koch发现霍乱弧菌 • 1 9 0 5 年埃及埃儿托检疫站首次分离到ElTor弧菌，与霍乱
弧菌甚为相似，但经过多年的观察并不致病或仅引起轻度 腹泻，直到1937-1958年发生4次爆发后才逐渐认识到 ElTor弧菌致病性 • 1992年10月印度马德拉斯发现了新菌型O139霍乱弧菌
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疑似菌落初步鉴定：
7.庆大平板培养18-24h后挑取可疑菌落进行动力观察， 如动力阴性，可进行最终阴性报告，如下图。
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• 注意：
• 1.动力试验阴性，无需进行血清制动试验。 • 2.任何一次动力阳性，都需进行血清制动试验并
霍乱弧菌实验室检测
霍乱弧菌的实验室检测
目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生 手段:
检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作?
霍乱概述
▪ 什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）
引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
霍乱病原菌
O139群（Bengal）
O2-O200群
腹泻病原菌
▪ 病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
▪ 发病特征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
菌落鉴定
▪ 染色镜检
革兰染色阴性的短杆菌
▪ 血清凝集试验：
➢分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行 对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 ➢生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型 血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落 为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型 血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试 管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些 小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此 如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 ➢生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与 O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行 进一步确认。
霍乱监测方案实验室流程
霍乱监测方案实验室流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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霍乱弧菌国标标准方法
霍乱弧菌国标标准方法
霍乱弧菌是一种引起霍乱的弧菌属细菌。
为了有效防控霍乱疫情，国家制定了
相关的标准方法来监测和检测霍乱弧菌的存在和潜在威胁。
以下是关于霍乱弧菌国标标准方法的介绍。
霍乱弧菌国标标准方法主要包括样品采集、实验室分析和结果解读三个方面。
1. 样品采集：根据国家标准方法，样品的采集需要遵循严格的卫生规范。
一般
来说，水样、食物样品和环境表面样品是常见的采集对象。
采集时需要使用无菌容器，避免样品污染。
同时，应根据实际情况选择合适的采集方法和采样点，确保能够准确反映被测对象的情况。
2. 实验室分析：实验室分析是判定霍乱弧菌是否存在的重要环节。
通常采用培
养法进行分析，包括选择适当的培养基、温度和时间等。
在培养过程中，需要注意避免其他细菌的污染，保证结果的准确性。
此外，也可以使用分子生物学技术如PCR检测方法进行快速和准确的分析。
3. 结果解读：根据国家标准方法，对于从采集到的样品中检出霍乱弧菌的，应
根据相应的标准或参考值来进行解读。
结果解读需要根据实验室分析的结果，结合相关的卫生标准来判断是否存在风险，以及是否需要采取相应的控制和预防措施。
综上所述，霍乱弧菌国标标准方法是一种用于监测和检测霍乱疫情的重要手段。
准确采集样品、实验室分析和结果解读是该方法的关键步骤。
通过执行国家标准方法，我们能够及时发现和控制霍乱弧菌的传播，从而保障公众的健康和安全。
霍乱检测操作规程
霍乱检测操作规程霍乱是一种由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，其症状包括剧烈腹泻、呕吐和腹痛。
霍乱具有高度传染性，因此在进行霍乱检测时需要遵循一定的操作规程，以确保实验室工作人员和社会公众的安全。
下面是一份霍乱检测的操作规程，以供参考。
1. 实验室准备：- 确保实验室设备和试剂的完好和有效性。
- 准备好所需的培养基、试剂和仪器。
- 提前准备好相关实验记录和报告模板。
2. 实验室设备清洁和消毒：- 定期对实验室设备进行清洁和消毒，特别是接触到样本的仪器和工具。
- 使用合适的消毒剂对实验台面、试剂架和实验室周边进行消毒。
3. 样本采集和处理：- 使用适当的个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。
- 选择合适的采样方法，如直肠拭子、粪便样本或病人的呕吐物。
- 将采样好的样本放入严密密封的容器中，避免样本泄漏和污染其他样本。
- 将样本尽快送往实验室进行处理，以确保有效的检测结果。
4. 霍乱检测方法：- 使用合适的实验方法和试剂进行霍乱的检测，如PCR、免疫学检测或培养方法。
- 按照试剂和仪器的说明书进行实验操作，确保准确和可靠的结果。
- 对实验过程中的废液和废物进行正确处理，以防止污染和传播。
5. 结果判读和报告：- 对检测结果进行仔细的观察和判断，根据标准判定结果的阴阳性。
- 将结果记录在实验记录中，并及时生成报告。
- 如有需要，将结果报告给相应的卫生部门和相关人员。
6. 实验室安全和废物处理：- 在实验室操作过程中，严格遵守实验室安全规定，确保操作人员的安全。
- 对实验室产生的废液和废物进行正确的处置和处理，以降低污染和传播的风险。
- 使用合适的方法和设备对操作台面和工具进行清洁和消毒。
7. 实验室记录和质量控制：- 对实验室操作进行详细的记录，包括样本信息、实验步骤和结果等。
- 定期进行质量控制实验，以确保实验的准确性和可靠性。
- 定期进行实验室内部和外部的质量评估，及时发现和纠正实验中的问题。
总结：霍乱检测的操作规程至关重要，它能确保实验室工作人员和社会公众的安全。
霍乱弧菌实验室检测完整版
中、重型病例 。 临床诊断病例：符合下列任一类病例均为临床诊断病例。 临床表现为轻、中、重型或中毒型病例，并在腹泻病患者日常生活用品或家居环境中
检出O1群或/和O139群霍乱弧菌；
在一起确认的霍乱暴发疫情中，暴露人群中临床表现为轻、中、重型或中毒型病例。 实验室确诊病例： 临床病人并粪便、呕吐物或肛拭子细菌培养分离到O1群或/和O139群霍乱弧菌 ； 在疫源检索中，粪便培养检出O1群或O139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
挑可疑菌落、多价血清凝集
胶体金层析 卡检测
胶体金层析 卡检测
核酸提取 荧光PCR检测
血清分型、生化鉴定
问题：实验时间；灵敏度；初筛；等待时间
标本的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、操作台、砧板、下水道口……
要求：位置、数量
运输：
C-B运输培养基（pH8.4） 碱性蛋白胨水：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，不要用 运输培养基用前预冷1-2小时，采样后不能立即运至实验室时，需冷藏
特定地区？
感染因素多样化
初级感染因素、衍生的感染因素
确诊 病例 采样检测
就诊
患者
- 临床及时发现病例 - 细致的流行病学调查 - 实验室检测与分析 - 信息整合 - 控制行动
标本-粪便、呕吐物、水体、食品、、、
前处理：运输、调pH
增菌：碱性蛋白胨水（水体：加十倍浓缩液），6h – 过 夜
涂平板，16h ： 4号琼脂、TCBS、庆大霉素
S
SS S
S
霍乱的实验室检查
霍乱的实验室检查(一)血液检查红细胞和血红蛋白增高，白细胞计数（10~20）×109/L或更高，中性粒细胞及单核细胞增多。
血清钾、钠、氯化物和碳酸盐降低，血pH下降，尿素氮增加。
治疗前由于细胞内钾离子外移，血清钾可在正常范围内，当酸中毒纠正后，钾离子移入细胞内而出现低钾血症。
(二)尿检查少数病人尿中可有蛋白质、红白细胞及管型。
(三)病原菌检查1.常规检查(1)粪便镜检可见黏液和少许红、白细胞。
取粪便或早期培养物涂片作革兰染色镜检，可见革兰阴性稍弯曲的弧菌，无芽孢，无荚膜。
O139群弧菌除了可产生荚膜外，其余与O1群弧菌同。
(2)悬滴检查将新鲜粪便作悬滴或暗视野显微镜检，可见运动活泼呈穿梭状的弧菌。
2.培养(1)增菌培养所有疑为霍乱病人的粪便，除作显微镜检外，均应作增菌培养。
粪便留取应在使用抗菌药物之前，且应尽快送到实验室作培养。
增菌培养基一般用pH8.4的碱性蛋白胨水，36~37℃培养6～8小时后表面能形成菌膜。
应进一步作分离培养、动力观察和制动试验。
(2)分离培养常用庆大霉素琼脂平皿或碱性琼脂平板。
前者为强选择性培养基，36~37℃培养8~10小时霍乱弧菌即可长成小菌落。
采用后者则需培养10~20小时。
选择可疑或典型菌落，用霍乱弧菌“O”抗血清作玻片凝集试验，若阳性即可出报告。
近年来国外亦有应用霍乱毒素基因的DNA探针作菌落杂交，可迅速鉴定出产毒素O1群霍乱弧菌。
3.免疫学试验制动试验取急性期病人的水样粪便或碱性胨水增菌培养6小时左右的表层生长物，先作暗视野显微镜检，观察动力。
如有穿梭样运动物时，则加入O1群多价血清一滴，若是O1群霍乱弧菌，由于抗原抗体作用，则凝集成块，弧菌运动停止。
如加O1群血清后，不能制止运动，应再用O139血清重复试验。
4.分子生物学检查PCR方法:近年来应用PCR技术来快速诊断霍乱。
检测基因亚单位CtxA、Zot和毒素协同菌毛基因(TcpA)。
根据TcpA 基因的不同DNA序列又可区别古典生物型和埃尔托生物型霍乱弧菌。
霍乱弧菌实验室检验技术PPT医学课件
快速诊断初步报告
1、快诊断实验阳性者同时涂片染色和悬 滴法观察，如镜检为革兰染色阴性弧菌 或悬滴细菌呈“鱼群穿梭样”运动，氧 化酶试验阳性，可作初诊报告。为开展 疫情处理提供依据；
2024/1/24
制动试验
暗视野/相差显微镜直接镜检，水样便滴 在玻片上，可见流星状动力的细菌；当 加入01/0139免疫血清后，运动停止即凝 集成块，根据这种特殊动力和制动试验， 可提早做出初步诊断。
注意：免疫血清使用浓度1：64，并尽可 能不加防腐剂
2024/1/24
胶体金免疫层析快诊
采用胶体金免疫层析双抗体夹心法， 检测标本中霍乱弧菌。以胶体金作 为标记物，交联抗霍乱弧菌单克隆 抗体，与样品中的霍乱弧菌结合。 形成双抗体夹心一步法，呈现出目 测可见的红色条带，显色程度与抗 原含量成正比。
霍乱实验室检测技术
2024/1/24
内容
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/24
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
增菌/二次增菌分离培养 所有粪便标本都 应接种碱性蛋白胨水培养基，放37℃增 菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培 养物，划线接种于强选择性碱性琼脂和 TCBS琼脂平板各两个。必要时进行二次 增菌
2024/1/24
疑似菌落初步鉴定：
每个碱性琼脂、TCBS琼脂平板上各挑取 5个以上(少于5个的全部挑取)疑似菌落接 种于营养琼脂平板/营养琼脂斜面或克氏 双糖置37℃18-24h纯培养(即每份样品至 少从2个分离平板上获得约10株可疑菌落 菌株)，取斜面纯培养物进行血清鉴定、 并涂片进行革兰氏染色及氧化酶试验等。
霍乱常用的实验室检查
霍乱常用的实验室检查
霍乱常用的实验室检查有：
(1)直接镜检：
①直接涂片染色：将标本涂片，固定后用1∶10稀释石炭酸复红染色和革兰氏染色，镜检有无典型弧菌。
典型霍乱弧菌互相连接平行排列，有如“鱼群”。
②悬滴标本：将标本制成悬滴，镜检细菌动力，最好用暗视野显微镜。
霍乱弧菌运动活泼，呈小鱼穿梭状。
(2)分离培养：将吐泻物直接或先经碱性胨水增菌后，接种于庆大霉素琼脂等培养基，容易检出霍乱弧菌。
应用荧光抗体检测粪便中霍乱弧菌，可于1～2小时内获得结果。
(3)血清学检查：可作血清凝集试验。
在发病第1～3日及第10～15日各取1份血清，若第2份血清的抗体效价比第1份增高4倍或4倍以上，有诊断参考价值。
(4)制动试验——快速诊断：在急性病人的水样便中含有大量弧菌，如悬滴检查阳性，再滴加不含防腐剂的霍乱多价血清(使用浓度为1∶64)，几分钟内细菌运动停止，凝集成块即为阳性。
若具备下列条件之一者，可确诊为霍乱：
①凡有腹泻、呕吐等症状，大便培养霍乱弧菌阳性者；
②霍乱流行期间，在疫区有典型霍乱症状，大便培养阴性，而无其他原因可查者；
③有吐泻症状，霍乱弧菌培养阴性，作血清凝集试验第2份血清抗体
效价呈4倍以上增高者。
在非疫区，凡有典型泻吐症状，在病原学检查未确定时，或在霍乱流行期间，曾接触过霍乱患者，有腹泻症状而无其他原因可查者，均应高度怀疑为霍乱，在给予积极处理的同时，应作大便培养，隔日1次，连续3次阴性者，才可以否定诊断，并作出疫情更正报告。
现在已经有霍乱的快速检测试剂盒了，检测就不用这么麻烦了。
霍乱诊断的方法有哪些
霍乱诊断的方法有哪些
霍乱（cholera）是一种由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）感染引起的急性消化道传染病。
诊断霍乱的方法包括以下几种：
1. 症状分析：医生会询问患者的病史以及出现的症状，如急性腹泻、呕吐、腹痛等。
2. 实验室检查：通过采集患者的粪便样本，进行霍乱弧菌的培养和鉴定。
同时，还可使用PCR（聚合酶链反应）检测霍乱弧菌的DNA。
3. 肠道涂片检查：通过显微镜观察患者的肠道涂片，寻找霍乱弧菌的存在。
这是一种快速的诊断方法，但可靠性较低。
4. 血液检查：霍乱会导致脱水和电解质紊乱，医生可能会要求进行血液检查，检查患者的电解质水平和肾功能等指标。
5. 传染病监测：当有霍乱疫情时，可通过监测患者群体的发病情况和病原学特征，及时发现和诊断霍乱。
需要注意的是，虽然上述方法可用于诊断霍乱，但确诊霍乱的最可靠方法是将病原学检测与临床表现相结合。
因此，若怀疑自己或他人患有霍乱，应及时就医寻
求专业的诊断和治疗。
霍乱的确诊标准
霍乱的确诊标准
1、流行病学资料：在发病前一周内，患者曾在疫情区域生活或与患有本病的人及其排泄物有过接触。
2、临床表现：如果患者出现剧烈的“米泔水”样腹泻、呕吐和严重脱水等症状，应考虑到本病的可能性。
此外，在疫情期间，对于没有其他原因解释的腹泻和呕吐患者，应将其视为疑似病例进行处理。
对于离开疫区不足5天即发生腹泻的患者，也应按照上述诊断标准进行考虑。
3、实验室检查：霍乱的确诊有赖于实验室的检查结果。
通过实验室检查，可以检测到患者体内是否存在霍乱弧菌，以及其是否产生毒素等关键指标。
这些指标可以帮助医生确诊患者是否患有霍乱。
霍乱标本采集方法
霍乱标本采集方法
标本采集
霍乱是烈性肠道传染病，检验标本主要以病人的大便为主，必要时呕吐物和被呕吐物污染的衣裤亦可作为标本。
一般采取新鲜粪便，或用棉拭子插入直肠内4～5cm采取。
病人标本最好床边接种，预计能在3h内进行培养者，可将肛拭子置于灭菌的含碱性蛋白胨水的试管中，或将10～15ml大便放在带盖的广口瓶中，送往实验室。
不能在3h 内进行接种或需送至较远实验室的，应将标本转至卡-布半固体运送培养基中送检，避免使用甘油盐水缓冲运送培养基。
送检标本应密封并派专人送达。
咽拭子标本
采集病人发病3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。
用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部;迅速将棉签放入装有3-5ml 保存液(含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液)15ml 外螺旋盖采样管中，的在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4 暂存并在12 小时内送达实验室，-20 以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70 冰箱。
霍乱弧菌实验室检验技术
抗原构造
O139群霍乱弧菌不被已知的O1-O138群霍乱弧 菌诊断血清所汇集。表明本菌的抗原性与O1群 和其它非O1群霍乱弧菌有明显区别。 革兰氏阴性菌的抗原性都是由细胞壁的脂多 糖（LPS）所决定。通过对O139群霍乱弧菌的 LPS进行化学分析和血清学分析后发现O139群 霍乱弧菌缺少O1群霍乱弧菌LPS中的特异性成 分。 通过两者进行提取其LPS然后进行被动溶血试 验与被动溶血抑制试验检测，结果显示两者抗 原性有显著不同。O139群霍乱弧菌有荚膜而 O1群霍乱弧菌无荚膜。
2012-5-4
两者不同点：
群所致病中有44 O139群所致病中有 44.3% 可发生腹部痉 139 群所致病中有 44. 也有引起严重粘液性腹泻的， 挛 ， 也有引起严重粘液性腹泻的 ， 进入 外周血液可引起发热， 外周血液可引起发热 ， 出现菌血症或败 血症。 印度出现20 例病人中有17 例发热、 20例病人中有 17例发热 血症 。 印度出现 20 例病人中有 17 例发热 、 白细胞增多。 白细胞增多 。 而 O1 群引起的病人未曾见 过。 鉴别两者， 必须通过血清学诊断 来区分。 血清学诊断来区分 鉴别两者 ， 必须通过 血清学诊断 来区分 。 22群与 139群血清有交叉汇集反应 群与O 群血清有交叉汇集反应， O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必 须用O22群弧菌吸收 群弧菌吸收， 须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。 ♦ 是国内交通检疫传染病之一。 ♦ 也是当今三种国际检疫传染病中最 严重的一种。
2012-5-4
霍乱病原菌发现
♦ 1883年德国科学家Koch发现霍乱弧菌 ♦ 1905年埃及埃儿托检疫站首次分离到
一起O139群霍乱疫情的实验室检测分析
一起O139群霍乱疫情的实验室检测分析目的对一起疑似霍乱疫情的病原菌进行实验室检测。
方法按照《霍乱防治手册》（第六版）对采集的480份标本进行霍乱弧菌检测。
结果O139霍乱弧菌血清凝集试验阳性的标本共16份，其中患者粪便（或肛拭）标本共10份，外环境样品6份。
结论这起疫情是一起因聚餐引起的霍乱O139暴发疫情。
标签：霍乱；实验室检测；暴发；疫情霍乱是由O1群或O139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，该病发病急，传播快，波及范围广，能引起大范围流行，属甲类传染病。
湖北省松滋市位于湖北省中南部，处于平原与丘陵结合地区，2012年8月曾发生一起输入性霍乱疫情，疫情的发生主要跟食用被霍乱弧菌污染的水产品，特别是甲鱼有关[1-2]。
2016年10月5日8时，松滋市疾控中心接到市人民医院电话报告一例疑似霍乱病例。
疾控中心立即组织相关专业人员赶赴现场核实调查处理并收集患者标本进行复核，复核鉴定结果为O139群霍乱弧菌阳性，毒力基因CTX阳性。
截止10月14日，该起暴发疫情累计报告病例10例（其中健康带菌者2例），所有病例均来自陈店镇夹马槽村婚宴就餐者。
结合流行病学特征，临床表现和实验室检测结果综合分析，确定这是一起因聚餐引起的霍乱O139暴发疫情。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 采样器材10 mL碱胨水管、含50 mL 10倍浓缩碱胨水的广口瓶，500 mL无菌广口瓶，一次性无菌采样袋，肛拭采样器，无菌棉签，一次性纸杯，酒精灯，灭菌规格板（5 cm2），10 mL复方中和剂管，10 mL无菌生理盐水管等。
1.1.2 检测试剂碱性蛋白胨水增菌液，庆大霉素琼脂培养基，TCBS琼脂，O1、O139群霍乱弧菌检测胶体金试剂，O1、O139群霍乱弧菌诊断血清，氧化酶试剂，革兰氏染液，营养琼脂，以上试剂均在有效期内使用。
1.2 方法1.2.1 检测标准对采集的所有标本均严格按照《霍乱防治手册》[3]（第六版）进行病原学检测。
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O1群和O139群抗原构造与血清分型
群特异性抗原 型 别 A 小川 + O139 B + C +少量 型特异性抗原
稻叶
彦岛 Байду номын сангаас139
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国内商品化的霍乱检测血清
国外血清：日本生研，泰国S&A血清等
进一步实验
氧化酶试验 1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸 二甲基对苯二胺水溶液
胶体金检测条 荧光PCR检测
检测工作中应关注的事项
样品的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… 监测：水样，水产品等
运输：
一般要求在3小时内室温（20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测 C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ：不是最佳的，尤其6小时内还不能进 行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。
分离培养要点（两管三板法）：
挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择 性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。 第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体， 划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号 ／ＴＣＢＳ平板，第三板）。
感染后可获牢固免疫力；再感染少见
局部黏膜免疫；抗菌抗体（O）；抗毒素抗体（B） O1群与O139群不存在交叉免疫保护作用。
病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
发病特征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
水产品分离流程及技术要点
水产品的采集与保存运送
通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生 动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处臵 涂抹采集： 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到 20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。 整体或局部采集： 在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，臵灭菌均 质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物， 则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨 水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外 壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。
1A+5B
所致疾病：烈性肠道传染病霍乱
传染源:病人/无症状带菌者,人是霍乱弧菌的唯一易感者 传播途径：粪-口途径 流行特征：地方性、季节性。
霍乱典型临床特征
患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”。 并发症有血容量减少， 循环衰竭及肾功能衰竭， 导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。
免疫性
注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只 是作为辅助检测的一种手段
霍乱弧菌胶体金免疫层析检测
荧光PCR检测霍乱弧菌
病例标本检测 环境和食品调查的初筛方法
O1群、 O139群双色荧光检测试剂盒 深圳生科源生物技术有限公司
O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序
直 标本（粪便等） 增菌培养（碱胨水） 接 6-8小时 分离培养 庆大霉素、4号、TCBS琼脂 10-20小时 玻片凝集阳性 （结合菌落、菌体形态） 凝集菌落或可疑菌落 纯培养 （营养琼脂或克氏双糖培养） 10-20小时 鉴定 分型 确诊报告 第二次 增菌 （碱胨水）
霍乱的实验室检测
霍乱概述
什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae） 引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
古典生物型 O1群 埃尔托生物型 霍乱弧菌 O139群（Bengal） 非O1群 O2-O200群 腹泻病原菌 小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC) 霍乱病原菌
胶体金、 荧光PCR 快速诊断
初步报告
检测工作中应关注的事项
生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流 程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒） 培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PH值、保存条件是否达标，分 离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使 用等） 可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分 纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平 板！！） 做好样品的相关登记记录。
水体分离流程及技术要点
水体的采集与保存运送
水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ℃ ）3小时内送达实验室 检测。
分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：
取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性 胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。 37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于碱性胨 水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／ 四号／ＴＣＢＳ平板）。
分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基
平板分离及可疑菌落挑取
可疑菌落挑取
经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前臵的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
进一步分型鉴定(省CDC进行)
噬菌体分型 PFGE脉冲场分型
霍乱快速检测技术的应用
针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌 后的菌液进行快速检测 胶体金快速检测卡
O1群霍乱胶体金标记快诊卡
荧光PCR快速检测试剂盒
O1群、
O139群霍乱胶体金标记快诊卡
O139群双色荧光检测试剂盒 霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒
粪便分离流程及技术要点
粪便的采集与保存运送
以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取 指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处 采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2）， 同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６ 小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 （或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。
致病物质
毒 素 霍乱肠毒素(CT) ：前噬菌体基因编码 小带联结毒素 Zot 增加肠黏膜通透性 副霍乱肠毒素Ace 肠段积液 侵袭力 鞭毛 菌毛：acf、tcpA
CT的结构
由1个A亚单位和5个B亚单 位构成的多聚体，不耐热。 （前噬菌体基因编码） B亚单位： 与小肠粘膜上皮细胞GM1 神经节苷脂受体结合；
培养特性：
营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱， pH:7.4-9.6快速生 长
检验依据：
WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册（1999年第五版）
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
粪便 水体 水产品，食品等
平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法
粘丝试验 0.5％去氧胆酸钠水 溶液
进一步实验
生化鉴定
生化鉴定管： 发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+） 精氨酸双水解酶（-） 霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）； 生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等 全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等
霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形 半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾 的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）
Ｏ１３９型霍乱弧菌在４号平板 和ＴＣＢＳ上的菌落形态
菌落鉴定
染色镜检
革兰染色阴性的短杆菌
血清凝集试验：
分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行 对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型 血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落 为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型 血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试 管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些 小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此 如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与 O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行 进一步确认。