RTPCR

RT-PCR

试剂配制

(1)O.1％DEPC水：l ml DEPC+1000 ml双蒸水，高压灭菌后用于配制RNA提取的相关试剂。如果浸泡RNA提取的相关器皿，则应在DEPC水配制后立即使用。(2)10 mg·ml-1溴乙锭：1 g溴乙锭溶于100 ml去离子水中，避光保存，溴乙锭的工作浓度为0.5µg·ml-1。

(3)5×TBE储存液:Tris 54g,硼酸 27.5g，EDTA pH8.0(固体NaOH调,先配100ml) 20ml，定容到1L。(每种药品都用蒸馏水先溶解，都比较难溶，再互溶效果好点。)

0.5×TBE工作液是5×TBE储存液稀释10倍。

(4)1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。凝胶的厚度一般在3-5mm之间。在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳。

RNA提取前的准备

1.组织保存：小鼠处死后脏器迅速冻存于液氮罐中。

2. 研钵，剪刀及镊子的处理

1) 自来水反复冲洗；2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；3) 自来水反复冲洗；4) 用锡箔纸包裹研钵研棒等，180度干烤4－8小时，除去RNAase

3. 枪头及EP管（0.5ml,1.5ml，5ml）的处理

1) 0.1%DEPC水浸泡1～2天；2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干（需几天）。

RT-PCR方法

总RNA的提取：

1.组织匀浆：先放入液氮入碾钵内，把分装放入液氮中的一份肝脏入碾钵内，碾磨，边加液氮边碾磨。用DEPC水处理的1.5ml的EP管刮下碾钵上的肝脏，加入1ml RNAVzol混匀。裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。室温放置5分钟。对于多糖、蛋白等杂质丰富的组织样品，匀浆后仍会存留有不溶物质，可12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取上清至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中。

2.分离：

在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿（1 ml RNAVzol加入0.2 ml氯仿），振荡器上充分振荡混匀30 秒，室温放置2-3分钟。12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中，每毫升RNAVzol约可吸取0.5～0.55 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。

3.沉淀：

按每毫升最初的RNAVzol加入0.5 ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。12,000 g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，每毫升最初的RNAVzol

加入1 ml 75%乙醇（可先加0.75ml的无水乙醇，再加灭菌的DEPC水），轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，12000 g，4℃离心5 min后小心弃去乙醇弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。室温倒置晾干（5～10分钟）。

4.溶解：

加入适量（50µl）DEPC 水或TE 缓冲液使RNA沉淀溶解，用手指轻弹后离心3-5 s。分装成两管，每管22µl，存放于-80℃保存（可保存半年）；另外再取5µlRNA加4µl 灭菌的DEPC水加1µl上样Buffer，准备跑电泳。

RNA的鉴定及定量：

取上述RNA溶液2µl溶于198µl DEPC水中，用紫外分光光度计检测260 nm的吸光度(OD)值及280 nm的吸光度(0D)值，并计算OD260 nm／OD280 nm的比值，测定所提取的总RNA的含量和纯度，用1.0％的琼脂糖电泳鉴定RNA有无降解。1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。凝胶的厚度一般在3-5mm 之间。在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳，恒定电压120V，跑15min，取出胶到凝胶成像系统拍照。

(3)引物设计及合成：

根据Genebank公布的相应的mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物设计软件设计引物，由有限公司合成。

基因名称上下游引物序列(5’to 3') 产物片断大小bp 退火温度℃

Forward primer GAAATCGTGCGTGACATTA

β-actin 475 54

Reverse primer ACTCATCGTACTCCTGCTTG

Forward primer CACCTTGACACTACACCCTT '

G-6-Pase 420 55.4 Reverse primer GTGGCTGTGAACACCTCT

Forward primer GCCAGCCTACGCCACCATA

GLUT4 345 56.26 Reverse primer ATGCCAACGATGAAGTTACAGG

(4)cDNA的合成：

逆转录反应体系按Fermentas的第一链cDNA合成试剂盒使用说明在冰浴上进行操作：

RNA 0.1-5µg(11.0µl) Oligo(dt)

primer 1.0µl

18

共12.0µl

轻轻混匀后，离心3～5sec，65℃孵育5 min，在冰浴上加入以下反应物。

5x Reaction Buffer 4.0µl Riobolock TM Rnase Inhibitor(20 u·µl-1) 1.0µl

10 mM dNTP Mix 2.0µl RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/μl) 1.0µl

共20.0µl

轻轻混匀后，离心，42℃孵育60 min，70℃孵育10 min终止反应，置冰浴上

进行后续实验或-20℃冷冻保存。

(5)以cDNA为模板进行PCR扩增反应：

取逆转录产物，在PCR管中分别加入相应引物，以20µl反应体系作PCR。

按GenStar的2×Taq PCR StarMix配制PCR反应液：

cDNA 1.0µl

正向引物（10µM） 1.0µl

反向引物（10µM） 1.0µl

2×Taq PCR StarMix 10.0µl

O 7.0µl

dd H

2

PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，各基因相应最佳退火温度退火45 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃最后延伸7 min。

(6)PCR扩增产物的检测分析：

取上述PCR扩增产物和D2000Maker于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，100V 2min后待样品出点样孔，改为80V电泳30min，紫外灯下观察，数码照相，DNA条带光密度用凝胶成像分析系统进行半定量分析。目的基因mRNA的表达水平用目的基因mRNA ／β-actin mRNA的比值来表示。