小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓细胞原代培养的步骤
小鼠骨髓细胞原代培养的步骤嘿，朋友们！今天咱来唠唠小鼠骨髓细胞原代培养这档子事儿。
你可别小瞧这小小的骨髓细胞，这里头的门道可不少哩！首先呢，你得准备好一只健康的小鼠。
就像厨师要准备新鲜的食材一样，这小鼠可得精挑细选。
把小鼠麻醉了，然后小心翼翼地把它固定好，可别让它乱动。
接下来，就是关键的一步啦！找到小鼠的骨头，用手术器械精准地把骨头取出来。
这就好比是在挖掘宝藏，得小心谨慎，不能有一点儿马虎。
把骨头弄干净后，用合适的工具把骨头敲碎，就像敲碎一块硬糖一样。
然后呢，把敲碎的骨头放到培养液里。
这培养液就像是细胞的小窝，得让它们舒舒服服地待在里面。
这时候，就需要你耐心地等待啦，就像等待花儿开放一样。
在等待的过程中，你可得时刻关注着，看看细胞们是不是在乖乖地生长。
这可不像种花儿，能直接看到它们长大，得用一些特别的方法去观察。
等细胞们长到一定程度，就得给它们换个更宽敞的地方啦，也就是传代培养。
这就好比是给孩子们换个更大的房间，让他们能更好地成长。
你想想看，这小小的骨髓细胞，从一只小鼠的身体里出来，经过我们的精心培养，就能变成好多好多的细胞。
这多神奇呀！就像魔术师一样，能把一样东西变成好多好多。
培养骨髓细胞可不是一件容易的事儿，需要我们细心、耐心，还得有技巧。
就像骑自行车一样，一开始可能会摔倒，但只要坚持，就能骑得稳稳当当。
在这个过程中，要是有一个步骤没做好，那可能就前功尽弃啦。
所以呀，每一步都得认真对待，不能有丝毫的马虎。
总之呢，小鼠骨髓细胞原代培养可真是个有趣又有挑战性的事儿。
要是你也感兴趣，那就赶紧试试吧，说不定你也能成为这方面的专家呢！。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。
（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。
实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。
配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。
（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。
（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
穿隔离衣，戴手套。
用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。
点燃酒精灯，安装吸管帽。
实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。
（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
小鼠骨髓间充质干细胞的原代培 养
一、立题依据1、小鼠骨髓间质干细胞原代培养的意义 有利于迚行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能不冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促迚细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而丌利于干细胞生长，一般以5%～
小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点
干细胞培养基的选择研究背景：小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。
小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。
广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。
他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。
但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。
按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。
问题应该出现在培养基配方上。
陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。
为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。
陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。
经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。
解决方案：百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。
建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。
陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。
选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014）实施步骤：1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材；2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液；3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好；4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。
结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。
目前已经传至20代。
对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。
要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。
案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。
其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。
最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。
2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。
常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。
3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。
4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。
将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。
消化时间和温度根据具体实验要求来确定。
5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。
然后将悬液离心，收集沉淀细胞。
细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。
6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。
7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。
根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。
一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。
8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。
以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
BMSCs成脂成骨分化实验总结
骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。
2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。
3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。
4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。
5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。
原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。
图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。
3d换液1次，分化12d。
待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。
成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。
图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察南京师范大学生命科学学院09070150 唐嘉艺摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。
由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。
传代培养是组织培养常规保种方法之一。
当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代培养要在严格的无菌条件下进行。
本次实验主要是为了培养能独立进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。
关键词：小鼠胚胎原代培养传代培养无菌前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求：一、供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。
二、要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。
三、细胞培养必需严格控制在无菌条件下。
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
培养细胞所用器材及试剂：1、设备（1）超净工作台（2）滤器（3）C O2培养箱（4）电热干燥箱2、器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪3、培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM1640，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。
血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。
平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养PPT课件
细胞生长曲线的绘制与分析
生长曲线绘制
通过定时记录细胞数量或密度，绘制出细胞的生长曲线，反映细 胞的生长规律和生长速率。
生长速率分析
分析生长曲线的变化趋势，计算细胞的生长速率，为优化培养条件 和提高细胞产量提供依据。
生长周期
通过生长曲线的绘制和分析，了解细胞的生长周期和倍增时间，有 助于控制细胞的传代和扩增。
细胞分裂增殖情况
观察细胞分裂增殖的情况，有 助于了解细胞的增殖能力和生 长潜力，为后续实验提供依据
。
细胞形态的观察与描述
细胞形态
在显微镜下观察细胞的形态，包括细胞大小、形 状、染色深浅以及核质比例等特征。
描述方法
采用专业术语和描述方式，准确描述细胞的形态 特征，为细胞鉴定和分类提供依据。
形态变化
在培养过程中，观察细胞形态的变化，有助于了 解细胞的生长和分化情况。
细胞计数与接种
对分离出的细胞进行计数， 并按照适当的密度接种到 培养容器中。
培养容器
选择适当的细胞培养容器， 如细胞培养瓶、平板等。
培养条件与维持
温度与湿度
将培养容器放置在恒温、恒湿的 培养箱中，保持温度和湿度适宜。
பைடு நூலகம்
气体环境
控制培养箱内的气体环境，如CO2 浓度，以维持培养基的pH值。
换液与传代
定期更换培养基，并适时进行细胞 的传代，以维持细胞的生长状态。
基础培养基
选择适合细胞生长的基础培养基，如 DMEM、RPMI等。
培养基的灭菌与储存
确保培养基经过严格灭菌，并在无菌 条件下储存。
添加成分
根据细胞类型和培养需求，添加适量 的生长因子、抗生素等。
细胞接种与培养
细胞分离
间充质干细胞的传代
【实验结果与分析】
观察表面抗原的免疫荧光染色结果： 【思考题 】 1、免疫荧光染色的步骤是什么，需要注意什么？ 2、怎样用荧光显微镜拍摄荧光照片？
A. 第五代骨髓间充质干细胞的形态学特征： 长梭形（黑色箭头）和扁平形（红色箭头），Bar= 50 μm
B-H.第五代BMSCs的免疫荧光鉴定结果（蓝色为Hoechst 33258染色，显示细胞核）
面是需要注意的？
(二) 间充质干细胞的传代、冻存及复苏
1.当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲 洗细胞两次。
2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37℃培养箱中2~3 min，取出 在显微镜下观察，当80~90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱 离瓶底时，移入超净台。
3.传代：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复 吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心 10 min。弃上清，加入10 ml培养基吹打混匀。接种于两 个培养瓶中。 4.冻存：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反 复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离 心10 min。弃上清，加入1 ml冻存液（FCS ：DMSO：LDMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻存管中，4℃放置 30~40 min，-20℃ 放置1 h，-80℃过夜，再移入液氮罐中。
2、BMSCs的诱导分化 1)成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以4×103/cm2的
接种密度培养在35 mm培养皿里，待细胞融合后 将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成脂肪 分化诱导液（高糖DMEM+10%血清+10 μg/ml胰岛 素+1 μM地塞米松+100 μM吲哚美辛+0.5 mM 3isobutyl-1-methylxanthine）培养，每隔3 d换诱导 液一次，持续诱导培养6 d。 然后用维持液（高糖 DMEM+10%胰岛素）继续培养细胞3 d。各组细胞 用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油红O 工作液浸染10 min，60%异丙醇洗去多余染液， PBS冲洗3次，苏木精复染3-5 min，PBS漂洗10 min。 镜下观察并摄影。
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小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
我上周拍了一套取BMC的全过程照片，本来打算抽空上传的，可是……哎！不知道你现在用的是什么培养液？哦，是原代啊！千万别等铺满啊，等不到的，再等细胞就都漂起来了～原代一般你看细胞集落内部非常密集了就可以传代了！！用Stemcell公司的产品可能在10天左右就该传了，如果用普通培养液，根据血清的效果，可能时间长个几天，但2周也该传了！主要目的是把细胞打散，可以2盘传到1盘里去，接种密度控制在1-2×10^5cells/cm.cm，密度宜高不宜低！祝好运！xjqhy0348 wrote:羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊不知道你在42天里都采取了什么措施没有？这么长时间不长如果期间没有在原瓶里重新贴壁处理的话很可能会导致干细胞分化。
另外细胞状态不好是不是和PH有关？换下培养液试试？不是高手，路过愿与各位探讨一下。
没什么不好意思的,应该不好意思的是我,缠着问你,能理我已经很高兴了,情况就是这样,我老等铺满,培养基是DMEM．明白了我再这样做一下，成功后向你报喜．由我来替你终结完整版，到时你再修改题外话，都象你这样，以后中国肯定很强大，谢谢你羽之无限版主年轻的海岸，你好，我的细胞也是一周前开始状态欠佳的，自己分析不是ＰＨ的原因，可能是未添加谷胺酰胺，４２天内，每３－４天换也液一次．你说的有可能，我看到了怀疑是脂肪细胞，仅仅是猜测．望以后多多指点．按羽之无限版主说的，明天就去传代，看看行不行flamerking wrote:呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
我上周拍了一套取BMC的全过程照片，本来打算抽空上传的，可是……哎！不知道你现在用的是什么培养液？哦，是原代啊！千万别等铺满啊，等不到的，再等细胞就都漂起来了～原代一般你看细胞集落内部非常密集了就可以传代了！！用Stemcell公司的产品可能在10天左右就该传了，如果用普通培养液，根据血清的效果，可能时间长个几天，但2周也该传了！主要目的是把细胞打散，可以2盘传到1盘里去，接种密度控制在1-2×10^5cells/cm.cm，密度宜高不宜低！祝好运！2盘传一盘啊？我以前都是一瓶传两瓶这样是不是密度太低的原因反正传代后长的非常慢干细胞有这个脾气，如果少了，它也不长，所以最好2传3，这样传，要是长得慢不妨原瓶传代，防止时间长了干细胞分化。
我也是这样,感觉第一次至多要1传1,以后可能快一点恩，这次试试一传一再给大家报告一下结果斑竹，支持你！有空教我，我就住在你2001年待过的campus！flamerking 版主的方法不错，可是能否把消化的方法也整理一下？小鼠骨髓干细胞贴壁非常牢固，不知道怎么消化下来本人每10cm盘用1只4-6W昆明小鼠下肢的2个股骨的骨髓，用全骨髓法贴壁，10％PAA FBS，约2周长满。
细胞消化液：Gibco的0.25%胰蛋白酶,1mmol/L EDTA（事先37℃预热），吸干培养液后用PBS洗了3遍，每10cm盘加1ml消化液，于37℃培养箱消化10分钟后，只有小部分细胞脱落，其余贴壁的依然为梭形、多边形和圆形。
用等量含血清的培养液终止，吹打细胞，仍旧贴的很牢。
我养人的BMSSC，用1ml上述消化液，37℃5min，细胞都成片脱落了。
消化时间过长会对细胞产生伤害，请问有没有更好的消化方法？谢谢！胰酶浓度应该够了啊，况且还加了EDTA请问你的细胞原代已经长了几天？若都完全铺满，恐怕消化效果就不是很好了我的原代一般6天左右铺满80％左右，就可以传代了只使用0.16％的胰酶消化，2min，37度后大部分细胞间隙增宽，开始变圆少部分已经开始脱落马上加培养基终止消化液的作用用吸管吹打，可以把90%的细胞吹下来少数细胞仍然贴在瓶底，形态仍然为三角形这些细胞是MSC的可能性不大，建议放弃但传代后的细胞生长速度真是太慢了！若消化10min，恐怕对细胞损伤很大这一张为消化前一天的照片screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=554 height=328title="Click to view full clip_image002.jpg (554 X 328)" border=0align=absmiddle>请问dugurui 兄和flamerking 版主是全骨髓法培养还是用分离液法？附上我全骨髓法培养的P0消化前的其中一个克隆，长了2周，差不多覆盖了70％，Tripsin+EDTA+吹打还是很难消化啊。
消化下了一部分约50％左右，我还是让它们在原来的培养皿上贴壁生长，第二天去看没有什么死细胞漂浮，大都贴壁了，长势还不错。
我都打算用塑料的东西把细胞刮下来，或者用国产玻璃培养瓶试试看，不知道能否行得通？请不吝赐教，谢谢！（缩略图，点击图片链接看原图）hbmssc,看你的细胞形态跟我养的差不多啊我也用的全骨髓法，传代时细胞消化倒是容易可就是第一代不太长2,动物手术及取材材料与设备：1)骨髓细胞冲洗液2）小镊子/眼科剪刀/血管钳（可选）/无菌手术铺巾3）培养皿/离心管4）培养液5）红细胞裂解液（可选）6）冰盒7）其他细胞培养的常规设备及器皿（具体如下图）其中最关键的是冲洗液，配方如下：骨髓细胞冲洗液：2% FBSPBS (PH7.2)1mM EDTA 2,动物手术及取材材料与设备：1)骨髓细胞冲洗液2）小镊子/眼科剪刀/血管钳（可选）/无菌手术铺巾3）培养皿/离心管4）培养液5）红细胞裂解液（可选）6）冰盒7）其他细胞培养的常规设备及器皿（具体如下图）其中最关键的是冲洗液，配方如下：骨髓细胞冲洗液：2% FBSPBS (PH7.2)1mM EDTA1,取6-12周龄C57B/6J雄性小鼠，脱颈处死后，75%酒精浸泡1-3min；注意：（1）酒精浸泡时间不宜太长，很多书上要求10min，其实大可不必，最多3min也够了，因为这些小鼠本来就是在SPF级环境下生长。
浸泡时间太长很多组织会被酒精固定，另外动物死亡时间太长，理论上对细胞活力有影响（实际上我没觉得有什么影响）。
（2）酒精浸泡的主要目的除了杀菌外，更重要的是使小鼠的毛发湿润，以便操作（干燥的毛发会飞得到处都是，污染超净台）。
（3）乘放酒精的器皿最好放在超净台下角落中，以免操作中打翻引起火灾（本人有一次差点着火）；但是也别放在脚踢得到的地方，以免打翻污染实验室（本人多次踢翻过）。
2，将浸泡后的小鼠稍稍晾干（使酒精稍微滴干一下，否则会把开刀巾湿透）转入超净台；3，沿股骨体表投影线（可见一条白色的肌肉交界线），用剪刀钝性插入直接接触骨膜，向两侧钝性剥离肌肉及关节处的肌肉附着点，完整取下股骨；同法取下胫骨。
注：（1）剥离干净肌肉是有技巧的，需要一定的操练，由于本人外科基本功比较好，所以剥个骨头只要30sec就够了，新手可能需要5-10min甚至更长，须耐心练习。
（2）如果要做的小鼠数量很多，或者操作者不熟练，使得整个操作时间大于半小时，那么推荐将获取的股骨和胫骨浸泡入冰上孵育的含有冲洗液或培养液的培养皿。
根据需要取下胫骨和股骨，我个人觉得胫骨比较好冲，所以每次都取。
4，用眼科剪刀将股骨/胫骨从骨干中间剪断，用2ml注射器进行冲洗骨髓腔，直到骨头发白，收集冲洗下的细胞悬液，转入离心管。
注：也可以用血管钳将骨段夹碎，然后反复冲洗或震荡漂洗，据说这样能获得更多的干细胞（我主观上感觉好像确实多些）。
接着可以进行红细胞裂解步骤，也可跳过该步骤直接离心后加入培养液进行全骨髓培养。
如果不进行红细胞裂解，那么离心后获得的pellet如下图，如果进行了红细胞裂解，那么pellet的颜色应该是乳白色（可能稍微带点红色，如果裂解不充分的话）。
对于小鼠，我个人认为不需要进行红细胞裂解。
5，弃上清，用培养液重悬，取出10ul，加入90ul3%冰醋酸溶液后混匀，进行细胞计数，每1-1.5*10^7个有核细胞接种一盘10cm培养皿。
注：3%冰醋酸可以裂解红细胞，无论是否做过红细胞裂解步骤，都应该再经此操作（防止裂解不充分而混入红细胞，影响计数准确性）；也可加入台盼蓝（细胞:台盼蓝:冰醋酸=1:1:8)，不过意义不是太大，因为死细胞其实并不多。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=405 height=540title="Click to view full 12.jpg (405 X 540)" border=0 align=absmiddle>3，原代细胞培养昨天正好传了第6代，消化时间1min左右，时间之短难以相信吧？还好我有现场目击证人，看我传代的有楼上的huimingsheng战友。