叶绿素a分光光度法..

分光光度法检测叶绿素a

叶绿素是植物光合作用中的重要色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。

一、水样的采集和保存

可根据工作需要进行分层采样。湖泊、水库采样500ml，池塘300ml，采样量视浮游植物分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。采样点及采样时间同浮游植物的采样或按需要进行。

水样采集后应放阴凉处，避免日光直射。最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（4-48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0~4℃）避光处。在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。预处理后的水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。

二、仪器与试剂

仪器

1)分光光度计

2)真空泵

3)离心机

4)乙酸纤维薄膜（孔径0.45μm）

5)抽滤器

6)刻度离心管（10ml）

试剂

1)1%碳酸镁溶液：称取1.0g细粉末碳酸镁（MgCO

）悬浮于100mL蒸馏水中。

3

每次使用时要充分摇匀

2)90%丙酮：丙酮和蒸馏水按照9:1混合，每次实验前现配现用（否则会出现

悬浮物）。

三、实验流程

1)以离心或过滤浓缩水样。在抽滤器上贴好乙酸纤维薄膜，用少量水将其湿润以便将薄膜固定在抽滤器上，倒入定量体积的水样（湖泊水样一般为500ml）进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kPa），水样接近抽滤完成时，在抽滤器的水样中滴入1-2滴1%碳酸镁悬浊液，水样抽完后继续保持一段时间，以减少滤膜上的水分，放入4℃冰箱干燥24小时供下一步使用。如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。

2)取出低温干燥后的带有浮游植物的滤膜，用90%丙酮定容到10ml，进行叶绿素萃取，静置20min，摇匀，使带有浮游植物的滤膜均匀溶解，用离心机（3000~4000r/min）离心10min。

3)以90%丙酮作为空白吸光度测定，放入1cm光程的比色皿中对样品吸光度进行校正。取样品上清液，放入1cm光程的比色皿中，分别读取750nm、663nm、465nm、630nm波长的吸光度，对叶绿素a含量进行测定。

四、计算方法

叶绿素a=(11.64×(D663-D750)-2.16×(D645-D750)+0.10×(D630-D750))×V1

V×δ

V——水样体积（L）；

D——吸光度；

V1——提取液定容后的体积（ml）

δ——比色皿光程(cm)。

五、实验原理

叶绿素a在645nm和663nm处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，为16.75，在663nm处较大，为82.04；叶绿素b在645nm和663nm处亦都有吸收，但与叶绿素a相反，在645nm处吸光系数较大，为45.60，在663nm处较小，为9.27。由此可知：叶绿素a的吸收峰值出现在663nm处，该吸收曲线延伸到645nm处，在此波长处的吸收系数不如在663nm处大，因此在计算公式中求算

叶绿素a的含量时，需扣除叶绿素b在645nm处的吸光度值，再进行计算。

此外有一部分叶绿素a会与镁离子结合形成叶绿素镁，在630nm波长处有吸收，也属于叶绿素a含量，应计算在内。

在750nm波长下测量吸光度目的是避免悬浮物质的干扰，一般测量水中的浑浊度所采用的波长为680nm，为避免在680nm处仍有叶绿素a产生的吸收值，故将测量浑浊度的波长选在710nm以上。在计算公式中，凡参与计算的各吸光度值都应减去750nm处的吸光度值，以扣除悬浮物质的干扰，其值应小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％，否则应重新过滤。标准分析方法要求，叶绿体色素提取液不能是浑浊状态，假定样品在663nm处的吸光度值为0.03，则在750nm 处的吸光度值不得大于0.0015，对试液的清澈程度要求很高。

利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯－比尔（Lambert Beer）定律计算出提取液中各色素的含量。