Southern blot
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实验八 Southern blot
实验目的：学习核酸杂交的基本过程和操作 Southern blot应用：
目的基因检测，定性 基因拷贝数，定量 基因诊断、病理机制研究、同源性分析
核酸杂交方法
Southern blot: DNA Northern blot: RNA 原位杂交：组织、细胞、菌落、染色体
1d
检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
（1） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I（10 u / μl）
16 μl 2 μl 2 μl
（2） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R Hind III（10 u / μl）
• 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保 鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜
实验步骤
• 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要 高出搪瓷盘边约10cm
实验步骤
•ຫໍສະໝຸດ Baidu在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜
实验步骤
五.固定
• 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽 在尼龙膜上画上槽的位置
影响杂交的因素
• 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的 探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测
待检基因
实验原理
核
杂交探针：
酸
基因组
变 性
cDNA
RNA 寡核苷酸
复性 （杂交）
杂交：碱基互补 >连续4bp形成双链 >连续17bp人基因特异杂交
Southern blot 过程
细胞(组织) 基因组DNA制备 限制性酶切
皿),洗2次, 每次摇动15分钟。
实验步骤
七.检测
• 将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 • 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 • 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 • 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 • 在缓冲液3中平衡3分钟。 • 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育
0.5-16小时。 • 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深
• 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联 固定
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链）
1d
转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定）
预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂）
杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交）
1d
洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针）
电泳分离
转移并固定于膜上
与标记探针杂交
杂交结果检测
凝胶 电泳
标记 待检基 marker 因组
变性 转移
印迹到尼 龙膜上
（看不见 条带）
与标记探 针杂交
洗膜
放射自显影 荧光
酶催化显色
探针 制备
转膜 后杂
交
检测
杂交结果的检测
抗体偶联物
酶底物
应用
Anti-Dig-AP
Anti-DigHRP Anti-Dig-or Streavidine-
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
前, 用TE洗去底物液，干燥保存。
影响杂交的因素
1）待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法
2）探针的性质(标记效率、浓度，核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择
3）杂交液体积、温度和杂交时间
体积越小,杂交动力学越高; DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃; 温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
组
5.酶切样品（1）
2
6.酶切样品（2）
7.基因组DNA10 mg
实验步骤
三.变性
• 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢 摇动20分钟。
• ddH2O洗2次。 • 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
实验步骤
四.转移 • 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿和 小玻璃板
实验步骤
• 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移 液管的滚动，赶走气泡
斑点杂交 液相杂交
芯片
实验流程图
基因重组与 转化
重组质粒提 取与鉴定
质粒大 量制备
细胞 培养
基因组 DNA制备
DNA浓度 测定
探针 制备
Southern blot
酶 切
PCR
实验原理
• Southern杂交是利用标记的探针（probe）与 膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片 段中是否存在与探针同源的序列
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
GFP fluorescine
CSPD,CDP-Star NBT/BCIP Naphthol-ASTR/fast red TMB/H2O2 DAB/ H2O2
膜化学发光 膜显色 组化
膜显色 组化
荧光显色
(5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐)
(氮蓝四唑)
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III）
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不 能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气 泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
实验目的：学习核酸杂交的基本过程和操作 Southern blot应用：
目的基因检测，定性 基因拷贝数，定量 基因诊断、病理机制研究、同源性分析
核酸杂交方法
Southern blot: DNA Northern blot: RNA 原位杂交：组织、细胞、菌落、染色体
1d
检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
（1） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I（10 u / μl）
16 μl 2 μl 2 μl
（2） HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R Hind III（10 u / μl）
• 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保 鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜
实验步骤
• 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要 高出搪瓷盘边约10cm
实验步骤
•ຫໍສະໝຸດ Baidu在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜
实验步骤
五.固定
• 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽 在尼龙膜上画上槽的位置
影响杂交的因素
• 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的 探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测
待检基因
实验原理
核
杂交探针：
酸
基因组
变 性
cDNA
RNA 寡核苷酸
复性 （杂交）
杂交：碱基互补 >连续4bp形成双链 >连续17bp人基因特异杂交
Southern blot 过程
细胞(组织) 基因组DNA制备 限制性酶切
皿),洗2次, 每次摇动15分钟。
实验步骤
七.检测
• 将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 • 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 • 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 • 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 • 在缓冲液3中平衡3分钟。 • 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育
0.5-16小时。 • 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深
• 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联 固定
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链）
1d
转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定）
预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂）
杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交）
1d
洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针）
电泳分离
转移并固定于膜上
与标记探针杂交
杂交结果检测
凝胶 电泳
标记 待检基 marker 因组
变性 转移
印迹到尼 龙膜上
（看不见 条带）
与标记探 针杂交
洗膜
放射自显影 荧光
酶催化显色
探针 制备
转膜 后杂
交
检测
杂交结果的检测
抗体偶联物
酶底物
应用
Anti-Dig-AP
Anti-DigHRP Anti-Dig-or Streavidine-
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
前, 用TE洗去底物液，干燥保存。
影响杂交的因素
1）待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法
2）探针的性质(标记效率、浓度，核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择
3）杂交液体积、温度和杂交时间
体积越小,杂交动力学越高; DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃; 温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
组
5.酶切样品（1）
2
6.酶切样品（2）
7.基因组DNA10 mg
实验步骤
三.变性
• 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢 摇动20分钟。
• ddH2O洗2次。 • 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
实验步骤
四.转移 • 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿和 小玻璃板
实验步骤
• 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移 液管的滚动，赶走气泡
斑点杂交 液相杂交
芯片
实验流程图
基因重组与 转化
重组质粒提 取与鉴定
质粒大 量制备
细胞 培养
基因组 DNA制备
DNA浓度 测定
探针 制备
Southern blot
酶 切
PCR
实验原理
• Southern杂交是利用标记的探针（probe）与 膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片 段中是否存在与探针同源的序列
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
GFP fluorescine
CSPD,CDP-Star NBT/BCIP Naphthol-ASTR/fast red TMB/H2O2 DAB/ H2O2
膜化学发光 膜显色 组化
膜显色 组化
荧光显色
(5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐)
(氮蓝四唑)
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III）
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不 能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气 泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤