纸片法测菌

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(2)培养基

液体培养基(改良沙保氏培养基):蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,加入约800 mL 蒸馏水溶解,然后定容到1000 mL,趁热过滤,三角瓶分装,包扎后121 ℃/30 min 灭菌,4℃保存。

固体培养基:蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,琼脂20g,加入约800 mL蒸馏水溶解,然后定容到1000 mL,趁热过滤,三角瓶分装,包扎后121 ℃/30 min灭菌,4℃保存。

(3)菌液的制备

用接种环分别挑取4℃斜面固体培养基上保存的各待测菌落3-5个,分别接种于4-5mL 制备好的液体培养基中,30℃孵育20h,使真菌处于指数生长期后期。取1mL活化后的该菌液于液体培养基中,按照之前的方法,30℃孵育20h,使真菌增殖。并用灭菌的液体培养基稀释,充分振匀分散并显微镜计数,使菌液含菌浓度保持在约108 cfu/mL左右。

(4)含药纸片的制备

将待测化合物分别用灭菌水配制成浓度为0.512 mg/mL的药液10 mL,再将该药液以倍半稀释的方法分别稀释成1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128共8个浓度,装入10 mL灭菌的离心管后备用,待第一轮测试完后如果抑制效果好,还可继续倍半稀释。将直径为6 mm的滤纸片置于培养皿内并封闭包装好,在高压灭菌锅内121 ℃/ 30 min灭菌,冷却后取出置于无菌操作台内,再取适量的纸片置于不同浓度药液中浸泡2h,使纸片上含有待测药物,置于紫外等下照射,备用。

(5)平板的准备

将配制好的固体培养基和10mL表面皿配套包扎灭菌,在无菌工作台上趁热将固体培养基倒入表面皿,使固体培养基在表面皿中的厚度为10-20mm,冷却备用。

(6)抑菌圈试验及MIC值测定

待平板冷却后,在无菌条件下用灭菌后的移液枪及枪头吸取菌液30 μL置于相应平板,将菌液用灭菌后的玻璃涂布环均匀涂散在固体琼脂平板上,然后将制备好的含药物的纸片小心贴于平板上,每个平板中放置4个不同浓度梯度的含药纸片,每种药物对每一种测试菌重复实验两个平板,同时做空白对照(不含药物

的滤纸片贴在含菌的固体琼脂平板上)。将贴好含药滤纸片的平板倒置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h,其中新型隐球菌培养36h,通过观察抑菌圈的大小和有无初步判断药物对测试菌的敏感性,还可以比较药物对不同测试菌的敏感性及其相对抑制活性,然后将无明显抑菌圈出现时的该浓度作为最小抑菌浓度(MIC)值,具体体外抗真菌活性数据见表2.4所示。

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