纸片法测菌

（2）培养基

液体培养基(改良沙保氏培养基)：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，加入约800 mL 蒸馏水溶解，然后定容到1000 mL，趁热过滤，三角瓶分装，包扎后121 ℃/30 min 灭菌，4℃保存。

固体培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，琼脂20g，加入约800 mL蒸馏水溶解，然后定容到1000 mL，趁热过滤，三角瓶分装，包扎后121 ℃/30 min灭菌，4℃保存。

（3）菌液的制备

用接种环分别挑取4℃斜面固体培养基上保存的各待测菌落3-5个，分别接种于4-5mL 制备好的液体培养基中，30℃孵育20h，使真菌处于指数生长期后期。取1mL活化后的该菌液于液体培养基中，按照之前的方法，30℃孵育20h，使真菌增殖。并用灭菌的液体培养基稀释，充分振匀分散并显微镜计数，使菌液含菌浓度保持在约108 cfu/mL左右。

（4）含药纸片的制备

将待测化合物分别用灭菌水配制成浓度为0.512 mg/mL的药液10 mL，再将该药液以倍半稀释的方法分别稀释成1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128共8个浓度，装入10 mL灭菌的离心管后备用，待第一轮测试完后如果抑制效果好，还可继续倍半稀释。将直径为6 mm的滤纸片置于培养皿内并封闭包装好，在高压灭菌锅内121 ℃/ 30 min灭菌，冷却后取出置于无菌操作台内，再取适量的纸片置于不同浓度药液中浸泡2h，使纸片上含有待测药物，置于紫外等下照射，备用。

（5）平板的准备

将配制好的固体培养基和10mL表面皿配套包扎灭菌，在无菌工作台上趁热将固体培养基倒入表面皿，使固体培养基在表面皿中的厚度为10-20mm，冷却备用。

（6）抑菌圈试验及MIC值测定

待平板冷却后，在无菌条件下用灭菌后的移液枪及枪头吸取菌液30 μL置于相应平板，将菌液用灭菌后的玻璃涂布环均匀涂散在固体琼脂平板上，然后将制备好的含药物的纸片小心贴于平板上，每个平板中放置4个不同浓度梯度的含药纸片，每种药物对每一种测试菌重复实验两个平板，同时做空白对照（不含药物

的滤纸片贴在含菌的固体琼脂平板上）。将贴好含药滤纸片的平板倒置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，其中新型隐球菌培养36h，通过观察抑菌圈的大小和有无初步判断药物对测试菌的敏感性，还可以比较药物对不同测试菌的敏感性及其相对抑制活性，然后将无明显抑菌圈出现时的该浓度作为最小抑菌浓度(MIC)值，具体体外抗真菌活性数据见表2.4所示。