蛋白提取方法及注意事项

组织蛋白提取

材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂

各种试剂比例：

PMSF：Lysis Buffer = 1:100

1、将组织称重，减去EP管重量

2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时

3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上

4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管

5、离心，12000转，4℃，30分钟

6、取上清至新的预冷的EP管

7、BCA定量

8、放入—80℃

线粒体蛋白提取

材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS

1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清

2、加入A200uL，放冰上10分钟

3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头

4、离心500rpm，4℃，5分钟

5、将上清移至离心管

6、离心1100rpm，4℃，20分钟

7、沉淀中加入200uLB，混匀

8、离心1100rpm，4℃，20分钟

9、弃上清

10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒，

11、得线粒体蛋白

12、定量后放-80℃冰箱。

细胞总蛋白提取

材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。

1、吸掉培基

2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀

3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽

4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。

培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 105

24孔培养板 2 1.0 5×105

12孔培养板 4.5 2.0 106

6孔培养板9.6 2.5 2.5×10680

3.5 cm 培养皿8 3.0 2×106

6 cm 培养皿21 5.0 5.2×106320

10 cm 培养皿55 10.0 13.7×106800

25cm2培养瓶25 5.0 5×106

75cm2培养瓶75 15～30 2×107

5、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。若不定量，在各个EP管中加入loading buffer（5×稀释成1×），冰上5分钟后，100度沸水中煮约5min，放入—80℃冰箱。

蛋白质定量：一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。

蛋白质样品制备注意事项

1 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

2 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸、多糖、脂类等干扰分

子。

3 制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。

4样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

5在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。