水溶性维生素的测定

第三节水溶性维生素的测定

水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足，但由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化需求外，任何多余量都会从机体中排出。为避免缺乏，需要经常由饮食来提供。

水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部被破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。

由于水溶性维生素具有上述特性，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。

测定水溶性维生素常用高效液相色谱法、荧光法、比色法和微生物法等。

一、维生素B1的测定(荧光法，GB/T5009.84—2003)

维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。

维生素B1在水中溶解度较大，在酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中加热极易分解。

近年来对利用带荧光检测器的高效液相色谱测定法进行了许多研究，并应用于实际试样测定。这里我们主要介绍荧光法（参考GB/T 5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定）

（一）荧光法

1．原理

试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素，在紫外线下，硫色素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂志分离，然后以所得溶液做测定。

2．试剂

⑴盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL；

⑵盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL；

⑶乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL；

⑷氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL；

⑸无水硫酸钠；

⑹乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL；

⑺氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL；

⑻酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL；

⑼1%铁氰化钾溶液（10g/L）：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存；

⑽碱性铁氰化钾溶液：取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用；

⑾正丁醇：需经重蒸馏后使用；

⑿淀粉酶和蛋白酶；

⒀活性人造浮石：称取200g 40目～60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存；

⒁硫胺素标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存；

⒂硫胺素标准中间液（10μg/mL）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月；

⒃硫胺素标准使用液（0.1mg/mL）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配；

⒄溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L 氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

3．仪器

⑴电热恒温培养箱；

⑵荧光分光光度计；

⑶Maizel-Gerson反应瓶；

⑷盐基交换管。

4．操作步骤

⑴试样制备

试样准备

样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻，用时将其解冻后使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。

提取

准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10μg～30μg,，一般称取2g～10g试样）置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，121℃30min，凉后取出。

用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。

按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45℃～50℃温箱过夜保温（约16h）。

凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。

净化

用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

用移液管加入提取液20mL ～60mL （使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2μg ～5μg ）。

加入约10mL 热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。

加入20mL250g/L 酸性氯化钾（温度为90℃左右），收集此液于25mL 刻度试管内。冷至室温，用250g/L 酸性氯化钾定容至25mL ，即为试样净化液。

重复上述操作，将20mL 硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。

氧化

将5mL 试样净化液分别加入A 、B 两个反应瓶。

在避光条件下将3mL150g/L 氢氧化钠加入反应瓶A ，将3mL 碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B ，振摇约15s ，然后加入10mL 正丁醇；将A 、B 两个反应瓶同时用力振摇1.5min 。

重复上述操作，用标准净化液将代替试样净化液。

静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2g ～3g 无水硫酸钠使溶液脱水。

⑵ 测定

荧光测定条件：

激发波长365nm ；发射波长435nm ；激发波狭缝5nm ；发射波狭缝5nm 。

依次测定下列荧光强度：

a. 试样空白荧光强度（试样反应瓶A ）；

b. 标准空白荧光强度（标准反应瓶A ）；

c. 试样荧光强度（试样反应瓶B ）；

d. 标准荧光强度（标准反应瓶B ）。

5．结果计算

1000

1001)(21⨯⨯⨯-⨯-=m V V S S cV U U X b b 式中 X —样品中硫胺素含量，mg/100g ；

U —样品荧光强度；

U b —样品空白荧光强度；

S —标准荧光强度；

S b —标准空白荧光强度；

c —硫胺素标准使用液浓度，μg/m L ；

V —用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL ；

V 1—样品水解后定容之体积，mL ；

V 2—样品用于净化的提取液体积，mL ；

m —样品质量，g ；

100/1000—样品含量由μg/g 换算成mg/100g 的系数。

6．说明及注意事项

⑴ 一般食品中的维生素B 1游离型的，也有结合型的，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸或酶水解，是结合型维生素B 1成为游离型，再采用此法测定。一般淀粉酶含有维生素B 1要用白土吸附去除，但需要迅速处理，否则酶活性降低。

⑵ 谷物类物质不需酶分解，样品粉碎后用250g/L 酸性氯化钾直接提取。

⑶ 样品与铁氰化钾溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持15s ，否则应再滴加铁氰化钾溶液1~2滴，因样品中含有还原性物质，而铁氰化钾用量不够时，硫胺素氧化不完全，但过多的铁氰化钾又会破坏硫胺素，其用量应恰当。