植物愈伤组织诱导培养实验指导

植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导一、实验目的；通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。

二、实验原理：根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。

即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。

愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。

三、实验容实验包括以下3部分容：实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存实验1-2、MS培养基的配制与灭菌实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。

2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。

本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。

MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。

另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。

3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。

3.2试剂（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

（2）MS培养基成分：①大量元素(母液Ⅰ)：NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4；②微量元素(母液Ⅱ)：KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O；③铁盐(母液Ⅲ)：FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O；④有机成分(母液,维生素和氨基酸)：肌醇、盐酸吡哆醇(维生素B6)、烟酸(V)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸；pp（3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

4、操作步骤（1）MS大量元素母液的配制按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序分别准确称量后，分别用50ml 烧杯，加入蒸馏水30 ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。

溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。

表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量（2）微量元素母液的配制按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。

表2 MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量*、**：因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g，溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。

（3）铁盐母液的配制常用的铁盐是FeSO4·7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。

配制时，按照扩大后的用量（表3），分别称取FeSO4·7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液(需加热溶解)，搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。

表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量（4）有机物母液的配制按照表4 中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有机物。

可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。

一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/L NaOH溶液溶解；VH（生物素）先用1mol/L NaOH溶液溶解；VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。

表4 MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量（5）激素母液的配制激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.1～2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。

称量激素要用感量为万分之一天平。

本实验选用激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

2，4-D母液的配制方法为：准确称取10mg 2,4-D，称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。

（6）在配制母液时注意事项：①培养基各试剂应使用分析纯。

②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。

③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期，并存放在4℃冰箱中。

使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。

5、结果记录与分析（1）记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。

（2）仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题，如是否产生浑浊或沉淀，并分析出现混浊的原因。

6、思考题（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么？（2）配置激素母液时，应注意些什么？实验1-2 植物组织培养基MS的配制与灭菌1、目的要求学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的接种与初代培养做准备。

2、基本原理在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。

由于培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此，培养基也是微生物繁殖的极好场所。

所以，必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗糖+1%琼脂，pH5.8。

配制1L为例，学习培养基的配制方法。

3、实验仪器和试剂（1）仪器、用具高压灭菌锅，超净工作台、分析天平(0.0001g)、pH计（或pH试纸）、微波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、烧杯（1000ml ）、量杯、量筒(1000ml ，100ml ，50ml)、耐热皮筋（或棉绳）、100 ml 三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、封口膜、定性滤纸等。

（2）试剂① 95%乙醇、1mol/L NaOH 、1mol/L HCl 。

② MS 培养基各母液、2-4D 母液、蔗糖、琼脂。

4、操作步骤（1）器皿准备 清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。

（2）计算母液使用量 根据下面公式量取母液：激素母液用量（mL ）=———————————————————— 配制1000ml 培养基需要加入各母液的量分别为：大量元素母液：100ml 微量元素母液：10ml 铁盐母液：10ml有机物母液：10ml 激素母液：10ml（3）配制母液取用量（mL ）＝配制的培养基体积（mL ） 母液的扩大倍数 培养基配制量（L ）*激素使用浓度（mg/L ）激素母液浓度（mg/ml ）称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml 左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。

每组配制MS固体培养基1000ml，培养基组成为：MS+1mg/L 2,4-D+3%蔗糖+1%琼脂(pH5.8)。

（4）pH值调节充分混合，待温度降至50℃～60℃时，用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCl溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。

（5）分装搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中(温度低于40℃以下琼脂就会凝固)，每瓶25mL-30 mL左右，1000mL培养基可以分装至30～40瓶，迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制者和配制日期，准备灭菌。

注意：分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。

（6）灭菌培养基含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，同时将接种用具，如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿（装有滤纸）等进行灭菌。

使用高压锅灭菌要注意以下几点：①检查灭菌锅外层锅水位，水量过少时应加蒸馏水。

把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶。

盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。

②排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至0.1Mpa(121℃)，控制压力表稳定在该压力下15分钟，即达到灭菌目的。

③灭菌后，先切断电源，让灭菌锅温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基，置于水平台子上，在室温下冷却，同时取出灭菌水、培养皿、镊子、解剖刀、滤纸等。

④灭菌后的培养基应在室温下放置2—3天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否灭菌彻底。

经检查没有杂菌生长时方可使用。

要求：每人准备培养基3-4瓶。

5、结果记录与分析（1）仔细记录培养基制备中，各种母液、试剂称量的量。

（2）观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。

6、思考题（1）培养基表达式：MS+1mg/L2-4D+2.5%蔗糖+1%琼脂，pH5.8，表达的含义是什么？实验1-3 胡萝卜愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。