分子生物学实验技术(核酸的凝胶电泳) PPT课件
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一、 琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
（一）凝胶的制备及电泳
（二）DNA的迁移速率决定因素
1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基
对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状
载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速
率向阳极迁移。
6×凝胶载样缓冲液
类型 6 ×缓冲液
0.25%溴酚蓝
I
0.25%二甲苯氰FF
40% (m/V)蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝
II
0.25%二甲苯氰FF
（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 有效分离范围
（%）
（bp）
3.5 1000~2000
5.0
80~500
8.0
60~400
12.0
40~200
15.0
25~150
20.0
6~100
二甲苯氰FF
460 260 160 70 60 45
溴酚蓝
100 65 45 20 15 12
注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;
15% Ficoll(Type400)水溶液
0.25%溴酚蓝
III 0.25%二甲苯氰FF
30%甘油水溶液
0.25%溴酚蓝 IV
40% (m/V)蔗糖水溶液
贮存温度 4℃ 室温 4℃ 4℃
（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE
TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比：
1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
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三、 脉冲场凝胶电泳
pulsed-field gel electrophoresis
PFGE
为何选PFGE？
超过一定大小的线状双链DNA分子在 琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该 极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几 乎与分子大小无关，而主要决定于电场 强度。但 PEGE 解决了这一问题。
2 凝胶SYBR Gold的染色
SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商 品名称。其与DNA结合的亲和力高，并 且结合后，能够极大增强荧光信号。
（四） 凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成 像，图像可以直接输出到计算机观察。
（五） 凝胶中DNA的回收
现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：
homogeneous electric field)
A-
B-
+B
+A
垂直交变电场系统
A-
B-
+B
+A
箝位匀强电场系统
A+B
+A B-
场翻转系统
-
+ 旋转胶系统
（三） 影响分辨率的因素
1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。
在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的 参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成 三维带状网格结构。
网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功 能交联剂的浓度。
CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺）
（二） 聚丙烯酰胺凝Fra Baidu bibliotek电泳种类
35~38 40~42
高强度琼脂糖 34~43
修饰的低熔点/ 25~35
凝点琼脂糖
35
超低熔点
8~15
25~30
低黏性低熔点琼
脂糖
38
30
90~95 85~90 85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
1 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。
2 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。
1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA
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二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200， 研究证实900夹角也非常有效的。
4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行， PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快；但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。
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1 凝胶的EB染色
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液， 于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶 中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
（4）当要知道DNA片段准确大小时， 凝胶应在无EB情况下电泳，电泳 结束后再用EB染色。
＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。
5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用 的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低 熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
凝结温度/℃
熔化温度/ ℃
标准琼脂糖
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。
（二） 凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待 电泳的样品相混合的一种缓冲液。
（一） PFGE 工作的基本原理
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交 替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作 出反应所需的时间取决于它的大小。
该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应 叫交替电场凝胶电泳。
A-
-B
B+
+A
脉冲电场电泳示意图
（二）PEGE类型
• 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) • 场翻转系统(field inversion) • 旋转胶系统(rotating gel) • 箝位匀强电场系统(contour-clamped
第四节 核酸的凝胶电泳
Nucleic Acid Gel Electrophoresis
Content of Table
前言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳
前言
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一， 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；
优点：（1）便于分离;（2）便于检测; （3）便于回收：
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
标准 (kb)
1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
高强度 低熔点 低黏度低
(kb)
(kb) 溶点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
核酸凝胶电泳的基本原理
1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状 态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移；
2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质， 电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的 核酸分子。
一、 琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
（一）凝胶的制备及电泳
（二）DNA的迁移速率决定因素
1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基
对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状
载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速
率向阳极迁移。
6×凝胶载样缓冲液
类型 6 ×缓冲液
0.25%溴酚蓝
I
0.25%二甲苯氰FF
40% (m/V)蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝
II
0.25%二甲苯氰FF
（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 有效分离范围
（%）
（bp）
3.5 1000~2000
5.0
80~500
8.0
60~400
12.0
40~200
15.0
25~150
20.0
6~100
二甲苯氰FF
460 260 160 70 60 45
溴酚蓝
100 65 45 20 15 12
注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;
15% Ficoll(Type400)水溶液
0.25%溴酚蓝
III 0.25%二甲苯氰FF
30%甘油水溶液
0.25%溴酚蓝 IV
40% (m/V)蔗糖水溶液
贮存温度 4℃ 室温 4℃ 4℃
（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE
TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比：
1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
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三、 脉冲场凝胶电泳
pulsed-field gel electrophoresis
PFGE
为何选PFGE？
超过一定大小的线状双链DNA分子在 琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该 极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几 乎与分子大小无关，而主要决定于电场 强度。但 PEGE 解决了这一问题。
2 凝胶SYBR Gold的染色
SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商 品名称。其与DNA结合的亲和力高，并 且结合后，能够极大增强荧光信号。
（四） 凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成 像，图像可以直接输出到计算机观察。
（五） 凝胶中DNA的回收
现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：
homogeneous electric field)
A-
B-
+B
+A
垂直交变电场系统
A-
B-
+B
+A
箝位匀强电场系统
A+B
+A B-
场翻转系统
-
+ 旋转胶系统
（三） 影响分辨率的因素
1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。
在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的 参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成 三维带状网格结构。
网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功 能交联剂的浓度。
CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺）
（二） 聚丙烯酰胺凝Fra Baidu bibliotek电泳种类
35~38 40~42
高强度琼脂糖 34~43
修饰的低熔点/ 25~35
凝点琼脂糖
35
超低熔点
8~15
25~30
低黏性低熔点琼
脂糖
38
30
90~95 85~90 85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
1 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。
2 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。
1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA
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二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200， 研究证实900夹角也非常有效的。
4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行， PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快；但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。
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1 凝胶的EB染色
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液， 于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶 中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
（4）当要知道DNA片段准确大小时， 凝胶应在无EB情况下电泳，电泳 结束后再用EB染色。
＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。
5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用 的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低 熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
凝结温度/℃
熔化温度/ ℃
标准琼脂糖
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。
（二） 凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待 电泳的样品相混合的一种缓冲液。
（一） PFGE 工作的基本原理
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交 替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作 出反应所需的时间取决于它的大小。
该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应 叫交替电场凝胶电泳。
A-
-B
B+
+A
脉冲电场电泳示意图
（二）PEGE类型
• 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) • 场翻转系统(field inversion) • 旋转胶系统(rotating gel) • 箝位匀强电场系统(contour-clamped
第四节 核酸的凝胶电泳
Nucleic Acid Gel Electrophoresis
Content of Table
前言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳
前言
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一， 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；
优点：（1）便于分离;（2）便于检测; （3）便于回收：
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
标准 (kb)
1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
高强度 低熔点 低黏度低
(kb)
(kb) 溶点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
核酸凝胶电泳的基本原理
1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状 态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移；
2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质， 电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的 核酸分子。