基因表达系统大肠杆菌表达系统共44页文档
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
THANKS FOR WATCHING
基因表达系统大肠杆菌表达系统
碱变性 Add 0.3 ml of Solution II (0.2 N NaOH, 1% SDS) , gently mix, Incubate at room temperature for 5 min. Note: The appearance of the suspension should change from very turbid to almost translucent.
7. 收集DNA， Centrifuge the sample for 15 min at 14,000 × g at room temperature.
29
8. 洗涤, 70% ethanol to each tube. Invert the tube several times to wash the pellet. Centrifuge for 5 min at 14,000 × g at room temperature.
1) 分子量、等电点 2) 信号肽 3) 糖基化 4) 蛋白酶裂解位点 5) 有无二硫键（根据C的数量初步判断）
2
3
分子量、等电点
4
信号肽
5
6
糖基化
7
蛋白酶裂解位点
8
• 2 分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒 的限制性内切酶位点
atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg
大肠杆菌表达系统课件
THANKS
感谢观看
3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
基因工程3大肠杆菌表达系统
01
02
最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。
第一节基因的表达系统与表达策略
容易获得较高浓度的细胞；
01
能利用易得廉价原料；
02
不致病、不产生内毒素；
03
发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
04
容易进行代谢调控；
05
容易进行DNA重组技术操作；
06
产物的产量、产率高，
07
产物容易提取纯化。
08
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
宿主细胞的选择
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
宿主细胞分为两大类：
真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 使目标基因以融合蛋白形式表达； 置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 对目标蛋白质作疏水性修饰。 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：
常用的大肠杆菌表达载体
01
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
03
迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
大肠杆菌基因表达系统
必须用cDNA或者是化学合成的基因。 外源基因不能带有内含子。
除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 强启动子、强转录终止子 可诱导性 合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等
理想原核表达载体具备的基本特征
1
2
5
4
3
A dividing E. coli
原核或噬菌体启动子
MCS
SD序列
终止子
条件：
组成结构：
必须选择一个有lacI的宿主菌。
tac P
Lac O
S导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
阻遏物
IPTG
2.分泌型表达载体
如：pIN III系列： 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-A1, pIN III-A2, pIN III-A3,
EcoR I
BamH I
凝血酶
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
EcoR I
BamH I
Xa因子
pGEX-3X的插入区：
Sma I
Sma I
其他融合蛋白系统
His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
细胞质
外膜
内膜
周间质
质粒
染色体
“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
01
碱性氨基酸
Leu、Ile
Arg、Lys
02
N
04
疏水氨基酸核心区
07
AlaGlySer
大肠杆菌表达系统详细表格课件
整合载体
整合载体的特点
整合载体可将外源基因整合到宿 主细胞的染色体上，实现稳定遗
传。
应用范围
整合载体适用于基因治疗、基因 组编辑等领域，可提高外源基因
在宿主细胞内的稳定性。
注意事项
整合载体的构建需谨慎选择整合 位点，以避免对宿主细胞基因组
造成不良影响。
噬菌体载体
噬菌体载体的特点
噬菌体载体利用噬菌体感染宿主细胞，将外源基 因表达于噬菌体表面。
宿主菌的基因改造与优化
01
02
03
04
基因敲除
去除不必要或有害的基因，提 高表达效率和稳定性。
基因定点突变
通过改变基因序列以改良宿主 菌的某些特性，如提高蛋白表
达量。
基因融会与串联
将多个基因串联或融会，以实 现多蛋白表达或增加蛋白表达
量。
质粒优化
改进质粒复制、拷贝数和稳定 性，提高重组蛋白的表达水平
感谢观看
。
2023
PART 04
大肠杆菌表达系统的载体 选择与构建
REPORTING
质粒载体
质粒载体的特点
注意事项
质粒载体是大肠杆菌表达系统中常用 的载体类型，具有自我复制能力强、 拷贝数高等特点。
质粒载体的构建需考虑选择合适的复 制子、挑选标记以及多克隆位点等要 素。
应用范围
质粒载体适用于克隆中到大型基因以 及基因簇，并能在宿主细胞内进行高 拷贝复制。
REPORTING
定义与特点
定义
大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆 菌作为宿主细胞，通过基因工程技术 将外源基因在宿主细胞内进行表达的 生物反应体系。
特点
大肠杆菌表达系统具有生长速度快、 培养成本低、易于工业化生产等优点 ，广泛应用于基因工程药物、酶制剂 、生物材料等的研发和生产。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。
诱导原理：Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。
大肠杆菌表达系统步骤不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。
基因构建参考密码子优化，蛋白纯化参考蛋白纯化专题。
以下内容主要包括蛋白表达鉴定：1.表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择•拿到质粒，离心（3000r/min；2min）•在质粒中加入TE（使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量），一般为（1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE）•将质粒与TE混匀，加入2μL混液于感受态细胞中•将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min•取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,•再次放入冰箱（4℃）中，3min•拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中•放入摇床（37℃; 195r）中, 30nim至60min; （最佳45min）•取出离心（3000r/min；2min）•去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL 悬液涂平板，（先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min）•把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）2. 表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度•每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”•将试管放入摇床（37℃；195r）中，（单抗3h左右；双抗4左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）），测OD值（0.6至0.8）•从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存•在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG（终浓度0.5mM最适）•视不同的载体选择适合的表达环境（PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。
第三章基因表达系统大肠杆菌表达系统
一的碳源.
• 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化
• 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
4
5
1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体 胞外表达载体
6
P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体
13
pAO815
可体外构建多拷贝
14
BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
15
4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长
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• 3、C-Mannosylation （甘露糖化） • sugar is linked to the protein through a carboncarbon bond.
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• 4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins. 糖基磷脂酰肌醇锚 • binding to the plasma membrane
35
毕赤酵母系统的注意事项 1. 2. 3. 4. 5. 严格无菌操作，防止污染；可以镜检 温度≤30C; 转化 PCR检测 诱导时间
36
酵母蛋白糖基化
大肠杆菌表达系统
用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录
乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。
酶基因，通过热诱导方式激发
T7 噬菌体启动子的转录。
这种方式可以使本底转录降到 很低的水平，尤其适用于表达
对大肠杆菌宿主有毒性的重组
蛋白质。
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNAHale Waihona Puke 聚合酶PL 启动子 cI857
T7 RNA 聚合酶基因
第25页，共86页，编辑于2022年，星期日
T7 表达系统
转录调控的机理 双质粒系统
一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启
动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗性标记
不能相同
调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG
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•
46、寓形宇内复几时，曷不委心任去 留。
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47、采菊东篱下，悠然见南山。
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48、啸傲东轩下，聊复得此生。
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49、勤学如春起之苗，不见其增，日 有所结 ，箪瓢 屡空， 晏如也 。
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！